1、生物化工专业毕业论文 精品论文 二氯甲烷降解菌的分离鉴定、降解特性及关键酶基因克隆与表达研究关键词：二氯甲烷降解菌 分离鉴定 降解特性 二氯甲烷脱卤素酶 基因克隆 基因表达摘要：本文通过选择性富集培养，从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌，并对所分离菌株进行生化鉴定以及 16SrDNA系统发育研究，进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究，以期为探索微生物对异型生物质（Xenobiotics）的转化与降解机理、典型有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供创新的技术支持与方法论指导。 本研究获得的主要结论如下： 1.从废水和活性污泥中分离筛选得到 2
2、 株二氯甲烷降解菌株，分别命名为 WZ-12 和 wh22 菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验（Biolog） 、全细胞脂肪酸分析、G+Cmol含量分析以及 16SrDNA 序列同源性分析，证明 WZ-12 和 wh22 菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中 WZ-12 菌株被鉴定为环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）的又一菌株；推测菌株 wh22 应当是梭形杆菌（Lysinibacillussphaericus）的又一菌株，首次发现了环状芽孢杆菌菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。 2.WZ-12 和 wh22 两株菌都有较宽的温度、p
3、H 及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的 pH 环境中，菌株对二氯甲烷的降解效率也最高；在 30、初始 pH6.0 的 MM 培养基中，WZ-12 菌株 72h 对二氯甲烷的降解效率达 85.23。而 wh22 菌株在 37、初始 pH6.0的 MM 培养基中 48h 的降解效率约 80.09。有机物的加入可使降解菌 WZ-12 对二氯甲烷的降解加速，其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh22 菌株的降解能力影响不大；WZ-12 和 wh22 菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制，降解率下降，符合非线性的高姆比兹模型。菌株 WZ-12 能适应高盐浓度生长，NaCl 浓度在
4、1060gL-1 范围生长良好，对CH2Cl2、CH2BrCl、C2H2Cl2 和 C2H4Cl2 均有降解能力，72h 降解效率分别为78.28、58.19、60.32和 45.08。 3.菌株 wh22 含有 1 个降解性质粒，分子量为 48.8kb，命名为 pRC11。初步建立了质粒 pRC11 的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒，可在不同种属菌株之间转移，以 E.coliDH5（dcm-）作为受体菌做质粒的接合转移试验，阳性转化子的转化频率为1.65105gofplasmidDNA。 4.通过设计基于二次多项式数学模型，对试验结果进行多元回归分析，得到了如下适用于 DCM 降解率预
5、测的经验关联式回归模型： y=75.13+0.51x1+23.47x2+1.51x3-0.38x1x2+0.29x1x3-11.42x2x3-0.088x12-0.063x22-21.25x32 采用响应面分析法，在摇瓶水平上，得到了菌株WZ-12 生物降解工艺的最优条件为：DCM 初始浓度 380mgL（X1） 、葡萄糖添加浓度 13.72mgL（X2） 、H2O2 添加浓度 115mgL（X3） 。在此条件下，预测得到的最大降解率为 93.18。对以上获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验验证，得到好氧降解率平均值为 92.880.27，与模型预测值（93.18）吻合较好，该降解率回
6、归模型为菌株 WZ-12 在生物法处理含 DCM 废气的应用有一定的指导意义。 5.对来自菌株 WZ-12 的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究，获得二氯甲烷脱卤素酶，纯酶分子量为 31kDa，比酶活提高了 8.27 倍，得率为 34.83，纯化倍数为 8.27。该酶为诱导酶，最佳产酶温度为 30，粗酶液在 50以下具备一定的耐热性能和稳定性，最佳产酶 pH 为6.5；该酶在 pH57 之间稳定较好，但当 pH 大于 7 或小于 5 时，稳定性急剧下降。Ca2+、Mg2+对酶活有增强作用，而 Cu2+、Zn2+和 Ba2+则抑制酶活性，Hg2+对酶活性抑制影响最大。 该脱卤素酶表观 Km 值
7、在 30（pH7.0）为5.2510-3molL，Vmax 为 3.6710-4molLmin，Kcat 为 6.97104S-1。该酶的底物特异性不高，可以催化 CH2Cl2、CH2Br2、CH2I2 和 CH2BrCl 脱卤。 6.从菌株 WZ-12 中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因 dcmR，并对克隆产物进行了Southern 杂交鉴定。dcmR 编码基因序列为 864bp，编码脱卤素酶蛋白大小为288 个氨基酸残基，预测分子量 321kDa。BLAST 比对结果显示，克隆的基因片段与 Methylobacteriumsp.DM4 的二氯甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6。蛋白的氨基末端约
8、 20-80aa 与 GST 有类似的结构域，中间约第 50 位-80 位 aa 间具有多个跟 GSH 的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用 SEQUIN 软件上传至 GenBank，得到序列登录号FJ405230。 7.通过构建具 T7 强启动子的 pET 高效表达载体（pET21a 和pET15b） ，转化 E.coli（DE3）RP，构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了 3 种表达载体，pET-21a-dcmR（no-tag）不含任何标签，其转化子的二氯甲烷脱卤素酶酶活（21.95UmL-1）高于原始菌株 WZ-12（14.26UmL-1） ，可直接用
9、于二氯甲烷生物降解的工程应用研究；pET-21a-dcmRwithhis-tag 引入了 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag） ，为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义；pET-15b-dcmRwithhis-tagandLVPRGSthrombin 在引入 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag）的同时，增加了凝血酶酶切位点，方便了 His-tag的切除。将 3 种原核表达载体转化 E.coli（DE3）RP 并诱导表达，得到了具有酶活性的融合蛋白。 8.探讨重组酶的表达特点和部分酶学性质。重组菌经IPTG 诱导后，细菌总蛋白表达量为 0.76gL，其中融合蛋白占总蛋白的
10、32.00，酶活最高达 25.78U/mL，酶的比活为 88.86U/mg 蛋白。重组菌周质中酶活 2.92UmL，胞内酶活 22.86UmL。重组菌产生的酶活力与比活较原降解菌株高 12 倍。利用融合蛋白 N 末端的 His-tag，经金属螯合亲和层析纯化后，得到了纯度较高的融合酶蛋白，酶蛋白的得率为 72，比活为 144.73Umg。凝血酶切除 His-tag 后，经 SDS-PAGE 测定，重组蛋白的分子量为 331kDa，与理论计算值 34kDa 相符。重组的二氯甲烷脱卤素酶在 pH6.5，温度 30有最大相对酶活。但重组的二氯甲烷脱卤素酶对温度和 pH 要敏感。最后，对重组菌的生长特
11、性和降解特性的研究表明，重组菌在 LB 培养基中的生长特性与原始菌株没有差别，生长至对数期 A600nm 值都可达到 2.4 左右。重组菌株 dcmR-1 在25h 的降解率达 90以上，降解效率比原降解菌株有明显提高。正文内容本文通过选择性富集培养，从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌，并对所分离菌株进行生化鉴定以及 16SrDNA 系统发育研究，进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究，以期为探索微生物对异型生物质（Xenobiotics）的转化与降解机理、典型有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供创新的技术支持与方法论指导。 本研究获得的主
12、要结论如下： 1.从废水和活性污泥中分离筛选得到 2 株二氯甲烷降解菌株，分别命名为 WZ-12 和 wh22 菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验（Biolog） 、全细胞脂肪酸分析、G+Cmol含量分析以及 16SrDNA 序列同源性分析，证明 WZ-12 和 wh22 菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中 WZ-12 菌株被鉴定为环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）的又一菌株；推测菌株 wh22 应当是梭形杆菌（Lysinibacillussphaericus）的又一菌株，首次发现了环状芽孢杆菌菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。 2
13、.WZ-12 和 wh22 两株菌都有较宽的温度、pH 及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的 pH 环境中，菌株对二氯甲烷的降解效率也最高；在 30、初始 pH6.0 的 MM 培养基中，WZ-12 菌株 72h 对二氯甲烷的降解效率达 85.23。而 wh22 菌株在 37、初始 pH6.0的 MM 培养基中 48h 的降解效率约 80.09。有机物的加入可使降解菌 WZ-12 对二氯甲烷的降解加速，其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh22 菌株的降解能力影响不大；WZ-12 和 wh22 菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制，降解率下降，符合非线性的高姆比兹模型。菌株
14、 WZ-12 能适应高盐浓度生长，NaCl 浓度在 1060gL-1 范围生长良好，对CH2Cl2、CH2BrCl、C2H2Cl2 和 C2H4Cl2 均有降解能力，72h 降解效率分别为78.28、58.19、60.32和 45.08。 3.菌株 wh22 含有 1 个降解性质粒，分子量为 48.8kb，命名为 pRC11。初步建立了质粒 pRC11 的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒，可在不同种属菌株之间转移，以 E.coliDH5（dcm-）作为受体菌做质粒的接合转移试验，阳性转化子的转化频率为1.65105gofplasmidDNA。 4.通过设计基于二次多项式数学模型，对试验结果
15、进行多元回归分析，得到了如下适用于 DCM 降解率预测的经验关联式回归模型： y=75.13+0.51x1+23.47x2+1.51x3-0.38x1x2+0.29x1x3-11.42x2x3-0.088x12-0.063x22-21.25x32 采用响应面分析法，在摇瓶水平上，得到了菌株WZ-12 生物降解工艺的最优条件为：DCM 初始浓度 380mgL（X1） 、葡萄糖添加浓度 13.72mgL（X2） 、H2O2 添加浓度 115mgL（X3） 。在此条件下，预测得到的最大降解率为 93.18。对以上获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验验证，得到好氧降解率平均值为 92.880.
16、27，与模型预测值（93.18）吻合较好，该降解率回归模型为菌株 WZ-12 在生物法处理含 DCM 废气的应用有一定的指导意义。 5.对来自菌株 WZ-12 的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究，获得二氯甲烷脱卤素酶，纯酶分子量为 31kDa，比酶活提高了 8.27 倍，得率为 34.83，纯化倍数为 8.27。该酶为诱导酶，最佳产酶温度为 30，粗酶液在 50以下具备一定的耐热性能和稳定性，最佳产酶 pH 为6.5；该酶在 pH57 之间稳定较好，但当 pH 大于 7 或小于 5 时，稳定性急剧下降。Ca2+、Mg2+对酶活有增强作用，而 Cu2+、Zn2+和 Ba2+则抑制酶活性，Hg
17、2+对酶活性抑制影响最大。 该脱卤素酶表观 Km 值在 30（pH7.0）为5.2510-3molL，Vmax 为 3.6710-4molLmin，Kcat 为 6.97104S-1。该酶的底物特异性不高，可以催化 CH2Cl2、CH2Br2、CH2I2 和 CH2BrCl 脱卤。 6.从菌株 WZ-12 中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因 dcmR，并对克隆产物进行了Southern 杂交鉴定。dcmR 编码基因序列为 864bp，编码脱卤素酶蛋白大小为288 个氨基酸残基，预测分子量 321kDa。BLAST 比对结果显示，克隆的基因片段与 Methylobacteriumsp.DM4 的二氯
18、甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6。蛋白的氨基末端约 20-80aa 与 GST 有类似的结构域，中间约第 50 位-80 位 aa 间具有多个跟 GSH 的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用 SEQUIN 软件上传至 GenBank，得到序列登录号FJ405230。 7.通过构建具 T7 强启动子的 pET 高效表达载体（pET21a 和pET15b） ，转化 E.coli（DE3）RP，构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了 3 种表达载体，pET-21a-dcmR（no-tag）不含任何标签，其转化子的二氯甲烷脱卤素酶酶活（21.95UmL-1）高于原始
19、菌株 WZ-12（14.26UmL-1） ，可直接用于二氯甲烷生物降解的工程应用研究；pET-21a-dcmRwithhis-tag 引入了 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag） ，为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义；pET-15b-dcmRwithhis-tagandLVPRGSthrombin 在引入 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag）的同时，增加了凝血酶酶切位点，方便了 His-tag的切除。将 3 种原核表达载体转化 E.coli（DE3）RP 并诱导表达，得到了具有酶活性的融合蛋白。 8.探讨重组酶的表达特点和部分酶学性质。重组菌经IPTG 诱导后，细菌
20、总蛋白表达量为 0.76gL，其中融合蛋白占总蛋白的32.00，酶活最高达 25.78U/mL，酶的比活为 88.86U/mg 蛋白。重组菌周质中酶活 2.92UmL，胞内酶活 22.86UmL。重组菌产生的酶活力与比活较原降解菌株高 12 倍。利用融合蛋白 N 末端的 His-tag，经金属螯合亲和层析纯化后，得到了纯度较高的融合酶蛋白，酶蛋白的得率为 72，比活为 144.73Umg。凝血酶切除 His-tag 后，经 SDS-PAGE 测定，重组蛋白的分子量为 331kDa，与理论计算值 34kDa 相符。重组的二氯甲烷脱卤素酶在 pH6.5，温度 30有最大相对酶活。但重组的二氯甲烷脱
21、卤素酶对温度和 pH 要敏感。最后，对重组菌的生长特性和降解特性的研究表明，重组菌在 LB 培养基中的生长特性与原始菌株没有差别，生长至对数期 A600nm 值都可达到 2.4 左右。重组菌株 dcmR-1 在25h 的降解率达 90以上，降解效率比原降解菌株有明显提高。本文通过选择性富集培养，从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌，并对所分离菌株进行生化鉴定以及 16SrDNA 系统发育研究，进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究，以期为探索微生物对异型生物质（Xenobiotics）的转化与降解机理、典型有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供
22、创新的技术支持与方法论指导。 本研究获得的主要结论如下： 1.从废水和活性污泥中分离筛选得到 2 株二氯甲烷降解菌株，分别命名为 WZ-12 和 wh22 菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验（Biolog） 、全细胞脂肪酸分析、G+Cmol含量分析以及 16SrDNA 序列同源性分析，证明 WZ-12 和 wh22 菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中 WZ-12 菌株被鉴定为环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）的又一菌株；推测菌株 wh22 应当是梭形杆菌（Lysinibacillussphaericus）的又一菌株，首次发现了环状芽孢杆菌
23、菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。 2.WZ-12 和 wh22 两株菌都有较宽的温度、pH 及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的 pH 环境中，菌株对二氯甲烷的降解效率也最高；在 30、初始 pH6.0 的 MM 培养基中，WZ-12 菌株 72h 对二氯甲烷的降解效率达 85.23。而 wh22 菌株在 37、初始 pH6.0的 MM 培养基中 48h 的降解效率约 80.09。有机物的加入可使降解菌 WZ-12 对二氯甲烷的降解加速，其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh22 菌株的降解能力影响不大；WZ-12 和 wh22 菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制
24、，降解率下降，符合非线性的高姆比兹模型。菌株 WZ-12 能适应高盐浓度生长，NaCl 浓度在 1060gL-1 范围生长良好，对CH2Cl2、CH2BrCl、C2H2Cl2 和 C2H4Cl2 均有降解能力，72h 降解效率分别为78.28、58.19、60.32和 45.08。 3.菌株 wh22 含有 1 个降解性质粒，分子量为 48.8kb，命名为 pRC11。初步建立了质粒 pRC11 的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒，可在不同种属菌株之间转移，以 E.coliDH5（dcm-）作为受体菌做质粒的接合转移试验，阳性转化子的转化频率为1.65105gofplasmidDNA。 4
25、.通过设计基于二次多项式数学模型，对试验结果进行多元回归分析，得到了如下适用于 DCM 降解率预测的经验关联式回归模型： y=75.13+0.51x1+23.47x2+1.51x3-0.38x1x2+0.29x1x3-11.42x2x3-0.088x12-0.063x22-21.25x32 采用响应面分析法，在摇瓶水平上，得到了菌株WZ-12 生物降解工艺的最优条件为：DCM 初始浓度 380mgL（X1） 、葡萄糖添加浓度 13.72mgL（X2） 、H2O2 添加浓度 115mgL（X3） 。在此条件下，预测得到的最大降解率为 93.18。对以上获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验
26、验证，得到好氧降解率平均值为 92.880.27，与模型预测值（93.18）吻合较好，该降解率回归模型为菌株 WZ-12 在生物法处理含 DCM 废气的应用有一定的指导意义。 5.对来自菌株 WZ-12 的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究，获得二氯甲烷脱卤素酶，纯酶分子量为 31kDa，比酶活提高了 8.27 倍，得率为 34.83，纯化倍数为 8.27。该酶为诱导酶，最佳产酶温度为 30，粗酶液在 50以下具备一定的耐热性能和稳定性，最佳产酶 pH 为6.5；该酶在 pH57 之间稳定较好，但当 pH 大于 7 或小于 5 时，稳定性急剧下降。Ca2+、Mg2+对酶活有增强作用，而 Cu
27、2+、Zn2+和 Ba2+则抑制酶活性，Hg2+对酶活性抑制影响最大。 该脱卤素酶表观 Km 值在 30（pH7.0）为5.2510-3molL，Vmax 为 3.6710-4molLmin，Kcat 为 6.97104S-1。该酶的底物特异性不高，可以催化 CH2Cl2、CH2Br2、CH2I2 和 CH2BrCl 脱卤。 6.从菌株 WZ-12 中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因 dcmR，并对克隆产物进行了Southern 杂交鉴定。dcmR 编码基因序列为 864bp，编码脱卤素酶蛋白大小为288 个氨基酸残基，预测分子量 321kDa。BLAST 比对结果显示，克隆的基因片段与 Meth
28、ylobacteriumsp.DM4 的二氯甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6。蛋白的氨基末端约 20-80aa 与 GST 有类似的结构域，中间约第 50 位-80 位 aa 间具有多个跟 GSH 的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用 SEQUIN 软件上传至 GenBank，得到序列登录号FJ405230。 7.通过构建具 T7 强启动子的 pET 高效表达载体（pET21a 和pET15b） ，转化 E.coli（DE3）RP，构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了 3 种表达载体，pET-21a-dcmR（no-tag）不含任何标签，其转化子的二氯甲烷
29、脱卤素酶酶活（21.95UmL-1）高于原始菌株 WZ-12（14.26UmL-1） ，可直接用于二氯甲烷生物降解的工程应用研究；pET-21a-dcmRwithhis-tag 引入了 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag） ，为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义；pET-15b-dcmRwithhis-tagandLVPRGSthrombin 在引入 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag）的同时，增加了凝血酶酶切位点，方便了 His-tag的切除。将 3 种原核表达载体转化 E.coli（DE3）RP 并诱导表达，得到了具有酶活性的融合蛋白。 8.探讨重组酶的表达特点和
30、部分酶学性质。重组菌经IPTG 诱导后，细菌总蛋白表达量为 0.76gL，其中融合蛋白占总蛋白的32.00，酶活最高达 25.78U/mL，酶的比活为 88.86U/mg 蛋白。重组菌周质中酶活 2.92UmL，胞内酶活 22.86UmL。重组菌产生的酶活力与比活较原降解菌株高 12 倍。利用融合蛋白 N 末端的 His-tag，经金属螯合亲和层析纯化后，得到了纯度较高的融合酶蛋白，酶蛋白的得率为 72，比活为 144.73Umg。凝血酶切除 His-tag 后，经 SDS-PAGE 测定，重组蛋白的分子量为 331kDa，与理论计算值 34kDa 相符。重组的二氯甲烷脱卤素酶在 pH6.5，
31、温度 30有最大相对酶活。但重组的二氯甲烷脱卤素酶对温度和 pH 要敏感。最后，对重组菌的生长特性和降解特性的研究表明，重组菌在 LB 培养基中的生长特性与原始菌株没有差别，生长至对数期 A600nm 值都可达到 2.4 左右。重组菌株 dcmR-1 在25h 的降解率达 90以上，降解效率比原降解菌株有明显提高。本文通过选择性富集培养，从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌，并对所分离菌株进行生化鉴定以及 16SrDNA 系统发育研究，进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究，以期为探索微生物对异型生物质（Xenobiotics）的转化与降解机理、典型
32、有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供创新的技术支持与方法论指导。 本研究获得的主要结论如下： 1.从废水和活性污泥中分离筛选得到 2 株二氯甲烷降解菌株，分别命名为 WZ-12 和 wh22 菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验（Biolog） 、全细胞脂肪酸分析、G+Cmol含量分析以及 16SrDNA 序列同源性分析，证明 WZ-12 和 wh22 菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中 WZ-12 菌株被鉴定为环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）的又一菌株；推测菌株 wh22 应当是梭形杆菌（Lysinibacillussphaer
33、icus）的又一菌株，首次发现了环状芽孢杆菌菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。 2.WZ-12 和 wh22 两株菌都有较宽的温度、pH 及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的 pH 环境中，菌株对二氯甲烷的降解效率也最高；在 30、初始 pH6.0 的 MM 培养基中，WZ-12 菌株 72h 对二氯甲烷的降解效率达 85.23。而 wh22 菌株在 37、初始 pH6.0的 MM 培养基中 48h 的降解效率约 80.09。有机物的加入可使降解菌 WZ-12 对二氯甲烷的降解加速，其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh22 菌株的降解能力影响不大；WZ-12 和
34、wh22 菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制，降解率下降，符合非线性的高姆比兹模型。菌株 WZ-12 能适应高盐浓度生长，NaCl 浓度在 1060gL-1 范围生长良好，对CH2Cl2、CH2BrCl、C2H2Cl2 和 C2H4Cl2 均有降解能力，72h 降解效率分别为78.28、58.19、60.32和 45.08。 3.菌株 wh22 含有 1 个降解性质粒，分子量为 48.8kb，命名为 pRC11。初步建立了质粒 pRC11 的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒，可在不同种属菌株之间转移，以 E.coliDH5（dcm-）作为受体菌做质粒的接合转移试验，阳性转化子的转化频率为1
35、.65105gofplasmidDNA。 4.通过设计基于二次多项式数学模型，对试验结果进行多元回归分析，得到了如下适用于 DCM 降解率预测的经验关联式回归模型： y=75.13+0.51x1+23.47x2+1.51x3-0.38x1x2+0.29x1x3-11.42x2x3-0.088x12-0.063x22-21.25x32 采用响应面分析法，在摇瓶水平上，得到了菌株WZ-12 生物降解工艺的最优条件为：DCM 初始浓度 380mgL（X1） 、葡萄糖添加浓度 13.72mgL（X2） 、H2O2 添加浓度 115mgL（X3） 。在此条件下，预测得到的最大降解率为 93.18。对以上
36、获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验验证，得到好氧降解率平均值为 92.880.27，与模型预测值（93.18）吻合较好，该降解率回归模型为菌株 WZ-12 在生物法处理含 DCM 废气的应用有一定的指导意义。 5.对来自菌株 WZ-12 的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究，获得二氯甲烷脱卤素酶，纯酶分子量为 31kDa，比酶活提高了 8.27 倍，得率为 34.83，纯化倍数为 8.27。该酶为诱导酶，最佳产酶温度为 30，粗酶液在 50以下具备一定的耐热性能和稳定性，最佳产酶 pH 为6.5；该酶在 pH57 之间稳定较好，但当 pH 大于 7 或小于 5 时，稳定性急剧下降。
37、Ca2+、Mg2+对酶活有增强作用，而 Cu2+、Zn2+和 Ba2+则抑制酶活性，Hg2+对酶活性抑制影响最大。 该脱卤素酶表观 Km 值在 30（pH7.0）为5.2510-3molL，Vmax 为 3.6710-4molLmin，Kcat 为 6.97104S-1。该酶的底物特异性不高，可以催化 CH2Cl2、CH2Br2、CH2I2 和 CH2BrCl 脱卤。 6.从菌株 WZ-12 中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因 dcmR，并对克隆产物进行了Southern 杂交鉴定。dcmR 编码基因序列为 864bp，编码脱卤素酶蛋白大小为288 个氨基酸残基，预测分子量 321kDa。BLAS
38、T 比对结果显示，克隆的基因片段与 Methylobacteriumsp.DM4 的二氯甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6。蛋白的氨基末端约 20-80aa 与 GST 有类似的结构域，中间约第 50 位-80 位 aa 间具有多个跟 GSH 的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用 SEQUIN 软件上传至 GenBank，得到序列登录号FJ405230。 7.通过构建具 T7 强启动子的 pET 高效表达载体（pET21a 和pET15b） ，转化 E.coli（DE3）RP，构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了 3 种表达载体，pET-21a-dcmR（n
39、o-tag）不含任何标签，其转化子的二氯甲烷脱卤素酶酶活（21.95UmL-1）高于原始菌株 WZ-12（14.26UmL-1） ，可直接用于二氯甲烷生物降解的工程应用研究；pET-21a-dcmRwithhis-tag 引入了 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag） ，为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义；pET-15b-dcmRwithhis-tagandLVPRGSthrombin 在引入 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag）的同时，增加了凝血酶酶切位点，方便了 His-tag的切除。将 3 种原核表达载体转化 E.coli（DE3）RP 并诱导表达，得到了具有酶
40、活性的融合蛋白。 8.探讨重组酶的表达特点和部分酶学性质。重组菌经IPTG 诱导后，细菌总蛋白表达量为 0.76gL，其中融合蛋白占总蛋白的32.00，酶活最高达 25.78U/mL，酶的比活为 88.86U/mg 蛋白。重组菌周质中酶活 2.92UmL，胞内酶活 22.86UmL。重组菌产生的酶活力与比活较原降解菌株高 12 倍。利用融合蛋白 N 末端的 His-tag，经金属螯合亲和层析纯化后，得到了纯度较高的融合酶蛋白，酶蛋白的得率为 72，比活为 144.73Umg。凝血酶切除 His-tag 后，经 SDS-PAGE 测定，重组蛋白的分子量为 331kDa，与理论计算值 34kDa
41、相符。重组的二氯甲烷脱卤素酶在 pH6.5，温度 30有最大相对酶活。但重组的二氯甲烷脱卤素酶对温度和 pH 要敏感。最后，对重组菌的生长特性和降解特性的研究表明，重组菌在 LB 培养基中的生长特性与原始菌株没有差别，生长至对数期 A600nm 值都可达到 2.4 左右。重组菌株 dcmR-1 在25h 的降解率达 90以上，降解效率比原降解菌株有明显提高。本文通过选择性富集培养，从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌，并对所分离菌株进行生化鉴定以及 16SrDNA 系统发育研究，进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究，以期为探索微生物对异型生物质（X
42、enobiotics）的转化与降解机理、典型有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供创新的技术支持与方法论指导。 本研究获得的主要结论如下： 1.从废水和活性污泥中分离筛选得到 2 株二氯甲烷降解菌株，分别命名为 WZ-12 和 wh22 菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验（Biolog） 、全细胞脂肪酸分析、G+Cmol含量分析以及 16SrDNA 序列同源性分析，证明 WZ-12 和 wh22 菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中 WZ-12 菌株被鉴定为环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）的又一菌株；推测菌株 wh22 应当是梭形杆
43、菌（Lysinibacillussphaericus）的又一菌株，首次发现了环状芽孢杆菌菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。 2.WZ-12 和 wh22 两株菌都有较宽的温度、pH 及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的 pH 环境中，菌株对二氯甲烷的降解效率也最高；在 30、初始 pH6.0 的 MM 培养基中，WZ-12 菌株 72h 对二氯甲烷的降解效率达 85.23。而 wh22 菌株在 37、初始 pH6.0的 MM 培养基中 48h 的降解效率约 80.09。有机物的加入可使降解菌 WZ-12 对二氯甲烷的降解加速，其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh2
44、2 菌株的降解能力影响不大；WZ-12 和 wh22 菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制，降解率下降，符合非线性的高姆比兹模型。菌株 WZ-12 能适应高盐浓度生长，NaCl 浓度在 1060gL-1 范围生长良好，对CH2Cl2、CH2BrCl、C2H2Cl2 和 C2H4Cl2 均有降解能力，72h 降解效率分别为78.28、58.19、60.32和 45.08。 3.菌株 wh22 含有 1 个降解性质粒，分子量为 48.8kb，命名为 pRC11。初步建立了质粒 pRC11 的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒，可在不同种属菌株之间转移，以 E.coliDH5（dcm-）作为受体菌做
45、质粒的接合转移试验，阳性转化子的转化频率为1.65105gofplasmidDNA。 4.通过设计基于二次多项式数学模型，对试验结果进行多元回归分析，得到了如下适用于 DCM 降解率预测的经验关联式回归模型： y=75.13+0.51x1+23.47x2+1.51x3-0.38x1x2+0.29x1x3-11.42x2x3-0.088x12-0.063x22-21.25x32 采用响应面分析法，在摇瓶水平上，得到了菌株WZ-12 生物降解工艺的最优条件为：DCM 初始浓度 380mgL（X1） 、葡萄糖添加浓度 13.72mgL（X2） 、H2O2 添加浓度 115mgL（X3） 。在此条件下
46、，预测得到的最大降解率为 93.18。对以上获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验验证，得到好氧降解率平均值为 92.880.27，与模型预测值（93.18）吻合较好，该降解率回归模型为菌株 WZ-12 在生物法处理含 DCM 废气的应用有一定的指导意义。 5.对来自菌株 WZ-12 的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究，获得二氯甲烷脱卤素酶，纯酶分子量为 31kDa，比酶活提高了 8.27 倍，得率为 34.83，纯化倍数为 8.27。该酶为诱导酶，最佳产酶温度为 30，粗酶液在 50以下具备一定的耐热性能和稳定性，最佳产酶 pH 为6.5；该酶在 pH57 之间稳定较好，但当 pH
47、 大于 7 或小于 5 时，稳定性急剧下降。Ca2+、Mg2+对酶活有增强作用，而 Cu2+、Zn2+和 Ba2+则抑制酶活性，Hg2+对酶活性抑制影响最大。 该脱卤素酶表观 Km 值在 30（pH7.0）为5.2510-3molL，Vmax 为 3.6710-4molLmin，Kcat 为 6.97104S-1。该酶的底物特异性不高，可以催化 CH2Cl2、CH2Br2、CH2I2 和 CH2BrCl 脱卤。 6.从菌株 WZ-12 中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因 dcmR，并对克隆产物进行了Southern 杂交鉴定。dcmR 编码基因序列为 864bp，编码脱卤素酶蛋白大小为288 个氨
48、基酸残基，预测分子量 321kDa。BLAST 比对结果显示，克隆的基因片段与 Methylobacteriumsp.DM4 的二氯甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6。蛋白的氨基末端约 20-80aa 与 GST 有类似的结构域，中间约第 50 位-80 位 aa 间具有多个跟 GSH 的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用 SEQUIN 软件上传至 GenBank，得到序列登录号FJ405230。 7.通过构建具 T7 强启动子的 pET 高效表达载体（pET21a 和pET15b） ，转化 E.coli（DE3）RP，构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了
49、3 种表达载体，pET-21a-dcmR（no-tag）不含任何标签，其转化子的二氯甲烷脱卤素酶酶活（21.95UmL-1）高于原始菌株 WZ-12（14.26UmL-1） ，可直接用于二氯甲烷生物降解的工程应用研究；pET-21a-dcmRwithhis-tag 引入了 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag） ，为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义；pET-15b-dcmRwithhis-tagandLVPRGSthrombin 在引入 6 个组氨酸残基“标签” （His-tag）的同时，增加了凝血酶酶切位点，方便了 His-tag的切除。将 3 种原核表达载体转化 E.coli（DE3）RP 并诱导表达，得到了具有酶活性的融合蛋白
