1、免疫学专业优秀论文 乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究关键词：酵母双杂交 MHBst 结合蛋白 基因克隆 乙型肝炎病毒 表面抗原摘要：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。 HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(
2、ORF)，分别命名为S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;
3、tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩
4、增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在
5、氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素l
6、t;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。正文内容乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻
7、找有效防治 HBV 的方法提供新线索。 HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有
8、反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降
9、低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基
10、上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因
11、并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与
12、宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，
13、羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱
14、饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp
15、-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出
16、的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很
17、大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55
18、 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合
19、型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBsl
20、t;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)
21、1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎
22、，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)
23、和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可
24、大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒
25、 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩
26、酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B vi
27、rus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3
28、 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tg
29、t;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，
30、Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基
31、 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其
32、在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结
33、构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验
34、应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 p
35、GBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖
36、基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性
37、结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X
38、区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还
39、不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短
40、的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序
41、，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在 TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的
42、“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HB
43、V 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程
44、中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达
45、95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western-blotting 验证。然后与转化了人白细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母细胞 Y187( 型)进行配合。 结果成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有 X-半乳糖(X-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落 10 个。提取阳
46、性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB 平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到 9 种已知基因，ADP 核糖基因子 2 个，RAB6 相互作用蛋白 1 个，CCR4-NOT 转录复合体亚基 10(CCR4-NOT-10)1 个，脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1 个，醛缩酶 B(AI,DOB)1 个，补体成分 3(C3)1 个，丙酮酸脱氢酶(PDH)1 个，人类细菌人工染色体(BAC)1 个。 为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表达载体 pGADT7，在
47、TNT 网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素lt;#39;35gt;S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实 LBP 可以与 MHBs 特异性结合。 本研究成功克隆出 MHBslt;#39;tgt;结合蛋白，为进一步研究其在 HBV 感染中的作用提供了新线索。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HBV 感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究 HBV 抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度
48、上对 HBV 的致病机制做出解释，为寻找有效防治 HBV 的方法提供新线索。HBV 基因组具有 4 个主要的开放读码框架(ORF)，分别命名为 S、C、P、X 区，其中 S 区通过三个框架(in-frame)内起始密码子(ATG)分为三个结构域：前-S1，前-S2 和 S 结构域，由此 3 个 ATG 开始编码产生 3 种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的 MHBs 多肽链是由 55 个 aa 的 PreS2 区和 226 个 aa 的 S 区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋
49、白(MHBslt;#39;tgt;)具有反式调节功能，在 HBV 致病(癌)过程中发挥着重要的作用，但 MHBslt;#39;tgt;与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。 为研究羧基末端截短形式的 HBV 表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型 cDNA 白细胞文库中与MHBslt;#39;tgt;的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母 a 和 接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率：在原技术基础上增加了 3 个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达 95。我们首先利用多聚酶链反应(PCR)方法扩增羧基末端 167 位 aa 截短的 HBV 表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体 pGBKT7 中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞 AHl09(a 型)并在其内表达，Western
