1、生物化学与分子生物学专业优秀论文 中药成分 CDP逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的研究关键词：中药成分 CDP 高甲基化 GSTP1 启动子 基因转染 MCF-7 萤光素酶报告基因 低转录活性 肿瘤细胞摘要：背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于
2、结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段
3、，在 Sss甲基化酶的作用下将所有CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动
4、子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低
5、转录活性。正文内容背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略
6、。 在本室前期初步验证中药成分CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pG
7、L3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组
8、，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观
9、测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化
10、的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤
11、光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、2
12、1.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为
13、抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有
14、CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa
15、酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化
16、是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具
17、有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39
18、;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，
19、呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含
20、量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 p
21、GL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转
22、录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过
23、构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 D
24、NA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切
25、鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改
26、变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)
27、作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，
28、并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-
29、GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对
30、荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列
31、区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前
32、期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pG
33、L3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报
34、告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基
35、化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 G
36、STP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后
37、 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。背景与目的:DNA 甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNMT)作用下，以 S-腺苷蛋氨酸(SAM)
38、为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶残基 C5上。哺乳动物的甲基化修饰通常发生在 CpG岛，CpG 岛指观测值/期望值大于 0.6并且 GC含量大于 50的 200bp以上的序列区域。哺乳动物基因组中 6090的 CpG都被甲基化，未甲基化的 CpG成簇地组成 CpG岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。作为抑癌基因，GSTP1 是一重要的 DNA损伤修复基因，其基因启动子区甲基化与多种肿瘤易感性相关。因此，通过药物干预，逆转甲基化的 GSTP1启动子区有望成为肿瘤治疗的新策略。 在本室前期初步验证中药成分 CDP具有抑制多种组织来源的肿瘤细胞的生长，并呈浓度、时间依赖性的基础上，本文将
39、进一步研究其逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子低转录活性的作用并探讨其作用机理。 方法:含非甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1pro由本实验室前期构建。利用 Kpn 、Xho 将 pGL3-GSTP1pro质粒双酶切，胶回收 GSTP1启动子区片段，在 Sss甲基化酶的作用下将所有 CpG位点甲基化，并用 Hpa 酶切鉴定甲基化的完整性。完全甲基化的 GSTP1启动子区片段与载体利用 T4连接酶进行连接，获得含完全甲基化的 GSTP1启动子区的重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;。利用转染试剂将pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt
40、;转入人乳腺癌细胞系(MCF-7)中，同时以去甲基化药物 CDP和 5-aza-C作用细胞，检测表达的萤光素酶活性。观察 GSTP1启动子转录活性的变化。 结果:重组质粒 pGL3-GSTP1prolt;#39;mgt;经 Kpn、Xho 双酶切得到的完全甲基化的 GSTP1启动子区片段，用对甲基化敏感的 Hpa 酶切鉴定，经修饰的片段长度酶切后无改变，表明重组质粒构建成功。药物处理后 72h，启动子区转录活性明显升高，10 mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组，随药物浓度增大，转录活性依次升高，呈剂量依赖性的关系。(非给药组，相对荧光素酶活性均值为 6.35,10
41、mol/L、30 mol/L、50 mol/L CDP 给药组相对荧光素酶活性均值分别为 18.23、21.75、24.83)。 结论:通过构建甲基化GSTP1启动子荧光素酶报告基因载体并转染 MCF-7细胞，证实中药成分 CDP能够逆转高甲基化状态的 GSTP1基因启动子区的低转录活性。特别提醒 ：正文内容由 PDF文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendob
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