wutac单抗血药浓度和人抗鼠抗体检测方法学的建立及其临床应用.doc

1、免疫学专业优秀论文 WuTac 单抗血药浓度和人抗鼠抗体检测方法学的建立及其临床应用关键词：血药浓度 药代动力学 抗体检测 T 淋巴细胞 单克隆抗体 给药方案摘要：人白细胞介素 2 受体 链（CD25）特异性地表达于活化的 T 淋巴细胞表面，为 T 淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制的抗人 T 淋巴细胞 CD25 鼠单克隆抗体（以下简称 WuTac） ，经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入期临床研究。本课题旨在建立人血清中 WuTac 单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照中国药典二部“药品质量

2、标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为 WuTac 药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测 WuTac期临床志愿者血样，对 WuTac 的药代动力学特征进行客观准确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。 建立定量检测 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法并进行方法学验证。用 WuTac 免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry 法对 WuTac 进行精确蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心 ELISA 法兔抗鼠

3、抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体的间接 ELISA 法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac 最佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对 114 份正常人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的 cutoff 值，并对方法的特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种 ELISA 方法分别对 WuTa

4、c期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac 单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析 WuTac 在人体中的药代动力学特点。 在定量检测血清 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法中，制备的兔抗鼠血清免疫双扩散效价大于 1：32，纯化后浓度为 77mg/ml，SDSPAGE 法测其纯度大于 90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔抗鼠抗体最佳包被浓度为 0625g/ml，HRP山羊抗鼠最佳稀释度为 1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和酶标抗体稀释液为 20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为 3

5、9125ng/ml（rgt;099） 。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml） 、中（625ng/ml） 、低（78ng/ml）三个浓度 WuTac 血样的回收率分别为 10224%、9874%、8944%，5 次测定回收率变异系数（CV 值）分别为 1034%、1091%、606%，重现性良好。测定精密度良好，高中低三个浓度板间精密度分别为 1034%、1091%、606%，板内精密度分别为1002%、1025%、718%。与人血清无交叉反应，高血脂，溶血对检测无影响。在定性检测抗鼠抗体的间接 ELISA 法，WuTac 最佳包被浓度为0313g/ml，最佳血清稀释

6、度为 1：200，HRP山羊抗人最佳稀释度为1：80000，阴阳性判定界值（cutoff 值）为 021，其板内板间变异系数分别为 746%803%和 548%147%，与马，山羊，兔，牛等动物血清无交叉反应。 检测结果表明，单剂量健康志愿者低、中、高三个剂量组药物半衰期（t1/2）分别为（37441284）h， （465620856）h， （5359221552）h，达峰时间（Tmax）分别为（20882064）h、 （2762016）h、 （24962016）h，峰浓度（Cmax）分别为（608958166）gL1、 （146123707）gL1 和（2950816560944）gL1，药

7、物曲线下面积（AUC0t）分别为（1105196281117）gL1d、 （34569071056242）gL1d、 （82811041996628）gL1d；多剂量肾移植志愿者药物半衰期（t1/2）为（50521702）h，达峰时间（Tmax）为药后（849616368）h，峰浓度（Cmax）为（3316082591894）g/L，曲线下面积 AUC0t 和 AUC0分别为（90108822279616）gL1d 和（94809122584407）gL1d。单剂量健康志愿者三个剂量组抗鼠抗体均产生在用药后第 1014 天，到第 35 天达到高峰，平均最高效价为 1：1600，个体最效价可达

8、1：3200；8 例肾移植病人用药后仅有 1 例出现抗鼠抗体，其余 7 例至术后第 40 天均未检测到 HAMA。 已建立的两种方法均符合国家对药代动力学研究检测方法学的要求；WuTac 在健康人和肾移植病人的代谢符合线性药代动力学的特征。正文内容人白细胞介素 2 受体 链（CD25）特异性地表达于活化的 T 淋巴细胞表面，为 T 淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制的抗人T 淋巴细胞 CD25 鼠单克隆抗体（以下简称 WuTac） ，经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入期临床研究。本课题旨在建

9、立人血清中 WuTac 单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照中国药典二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为 WuTac 药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测 WuTac期临床志愿者血样，对 WuTac 的药代动力学特征进行客观准确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。 建立定量检测WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法并进行方法学验证。用 WuTac 免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry 法对 WuTac 进行精确

10、蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心 ELISA 法兔抗鼠抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体的间接 ELISA 法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac 最佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对 114 份正常人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的 cutoff 值，并对方法的

11、特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种 ELISA 方法分别对 WuTac期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac 单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析 WuTac 在人体中的药代动力学特点。 在定量检测血清 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法中，制备的兔抗鼠血清免疫双扩散效价大于 1：32，纯化后浓度为 77mg/ml，SDSPAGE 法测其纯度大于 90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔抗鼠抗体最佳包被浓度为 0625g/ml，HRP山羊抗鼠最佳稀释度为 1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和

12、酶标抗体稀释液为 20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为 39125ng/ml（rgt;099） 。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml） 、中（625ng/ml） 、低（78ng/ml）三个浓度 WuTac 血样的回收率分别为 10224%、9874%、8944%，5 次测定回收率变异系数（CV 值）分别为 1034%、1091%、606%，重现性良好。测定精密度良好，高中低三个浓度板间精密度分别为 1034%、1091%、606%，板内精密度分别为1002%、1025%、718%。与人血清无交叉反应，高血脂，溶血对检测无影响。在定性检测抗鼠抗体

13、的间接 ELISA 法，WuTac 最佳包被浓度为0313g/ml，最佳血清稀释度为 1：200，HRP山羊抗人最佳稀释度为1：80000，阴阳性判定界值（cutoff 值）为 021，其板内板间变异系数分别为 746%803%和 548%147%，与马，山羊，兔，牛等动物血清无交叉反应。 检测结果表明，单剂量健康志愿者低、中、高三个剂量组药物半衰期（t1/2）分别为（37441284）h， （465620856）h， （5359221552）h，达峰时间（Tmax）分别为（20882064）h、 （2762016）h、 （24962016）h，峰浓度（Cmax）分别为（608958166）g

14、L1、 （146123707）gL1 和（2950816560944）gL1，药物曲线下面积（AUC0t）分别为（1105196281117）gL1d、 （34569071056242）gL1d、 （82811041996628）gL1d；多剂量肾移植志愿者药物半衰期（t1/2）为（50521702）h，达峰时间（Tmax）为药后（849616368）h，峰浓度（Cmax）为（3316082591894）g/L，曲线下面积 AUC0t 和 AUC0分别为（90108822279616）gL1d 和（94809122584407）gL1d。单剂量健康志愿者三个剂量组抗鼠抗体均产生在用药后第 10

15、14 天，到第 35 天达到高峰，平均最高效价为 1：1600，个体最效价可达 1：3200；8 例肾移植病人用药后仅有 1 例出现抗鼠抗体，其余 7 例至术后第 40 天均未检测到 HAMA。 已建立的两种方法均符合国家对药代动力学研究检测方法学的要求；WuTac 在健康人和肾移植病人的代谢符合线性药代动力学的特征。人白细胞介素 2 受体 链（CD25）特异性地表达于活化的 T 淋巴细胞表面，为T 淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制的抗人 T淋巴细胞 CD25 鼠单克隆抗体（以下简称 WuTac） ，

16、经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入期临床研究。本课题旨在建立人血清中 WuTac 单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照中国药典二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为 WuTac 药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测 WuTac期临床志愿者血样，对 WuTac 的药代动力学特征进行客观准确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。 建立定量检测WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法并进行方法学验证。用 WuTac 免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清

17、，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry 法对 WuTac 进行精确蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心 ELISA 法兔抗鼠抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体的间接 ELISA 法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac 最佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对 114 份正常

18、人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的 cutoff 值，并对方法的特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种 ELISA 方法分别对 WuTac期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac 单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析 WuTac 在人体中的药代动力学特点。 在定量检测血清 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法中，制备的兔抗鼠血清免疫双扩散效价大于 1：32，纯化后浓度为 77mg/ml，SDSPAGE 法测其纯度大于 90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔抗鼠抗体最佳包被浓度为 0625g/ml，HRP山羊抗鼠最佳稀释度为

19、1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和酶标抗体稀释液为 20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为 39125ng/ml（rgt;099） 。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml） 、中（625ng/ml） 、低（78ng/ml）三个浓度 WuTac 血样的回收率分别为 10224%、9874%、8944%，5 次测定回收率变异系数（CV 值）分别为 1034%、1091%、606%，重现性良好。测定精密度良好，高中低三个浓度板间精密度分别为 1034%、1091%、606%，板内精密度分别为1002%、1025%、71

20、8%。与人血清无交叉反应，高血脂，溶血对检测无影响。在定性检测抗鼠抗体的间接 ELISA 法，WuTac 最佳包被浓度为0313g/ml，最佳血清稀释度为 1：200，HRP山羊抗人最佳稀释度为1：80000，阴阳性判定界值（cutoff 值）为 021，其板内板间变异系数分别为 746%803%和 548%147%，与马，山羊，兔，牛等动物血清无交叉反应。 检测结果表明，单剂量健康志愿者低、中、高三个剂量组药物半衰期（t1/2）分别为（37441284）h， （465620856）h， （5359221552）h，达峰时间（Tmax）分别为（20882064）h、 （2762016）h、 （

21、24962016）h，峰浓度（Cmax）分别为（608958166）gL1、 （146123707）gL1 和（2950816560944）gL1，药物曲线下面积（AUC0t）分别为（1105196281117）gL1d、 （34569071056242）gL1d、 （82811041996628）gL1d；多剂量肾移植志愿者药物半衰期（t1/2）为（50521702）h，达峰时间（Tmax）为药后（849616368）h，峰浓度（Cmax）为（3316082591894）g/L，曲线下面积 AUC0t 和 AUC0分别为（90108822279616）gL1d 和（9480912258440

22、7）gL1d。单剂量健康志愿者三个剂量组抗鼠抗体均产生在用药后第 1014 天，到第 35 天达到高峰，平均最高效价为 1：1600，个体最效价可达 1：3200；8 例肾移植病人用药后仅有 1 例出现抗鼠抗体，其余 7 例至术后第 40 天均未检测到 HAMA。 已建立的两种方法均符合国家对药代动力学研究检测方法学的要求；WuTac 在健康人和肾移植病人的代谢符合线性药代动力学的特征。人白细胞介素 2 受体 链（CD25）特异性地表达于活化的 T 淋巴细胞表面，为T 淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制

23、的抗人 T淋巴细胞 CD25 鼠单克隆抗体（以下简称 WuTac） ，经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入期临床研究。本课题旨在建立人血清中 WuTac 单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照中国药典二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为 WuTac 药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测 WuTac期临床志愿者血样，对 WuTac 的药代动力学特征进行客观准确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。 建立定量检测WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法并进行方法学验证。用 WuT

24、ac 免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry 法对 WuTac 进行精确蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心 ELISA 法兔抗鼠抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体的间接 ELISA 法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac 最

25、佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对 114 份正常人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的 cutoff 值，并对方法的特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种 ELISA 方法分别对 WuTac期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac 单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析 WuTac 在人体中的药代动力学特点。 在定量检测血清 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法中，制备的兔抗鼠血清免疫双扩散效价大于 1：32，纯化后浓度为 77mg/ml，SDSPAGE 法测其纯度大于 90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔

26、抗鼠抗体最佳包被浓度为 0625g/ml，HRP山羊抗鼠最佳稀释度为 1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和酶标抗体稀释液为 20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为 39125ng/ml（rgt;099） 。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml） 、中（625ng/ml） 、低（78ng/ml）三个浓度 WuTac 血样的回收率分别为 10224%、9874%、8944%，5 次测定回收率变异系数（CV 值）分别为 1034%、1091%、606%，重现性良好。测定精密度良好，高中低三个浓度板间精密度分别为 1034

27、%、1091%、606%，板内精密度分别为1002%、1025%、718%。与人血清无交叉反应，高血脂，溶血对检测无影响。在定性检测抗鼠抗体的间接 ELISA 法，WuTac 最佳包被浓度为0313g/ml，最佳血清稀释度为 1：200，HRP山羊抗人最佳稀释度为1：80000，阴阳性判定界值（cutoff 值）为 021，其板内板间变异系数分别为 746%803%和 548%147%，与马，山羊，兔，牛等动物血清无交叉反应。 检测结果表明，单剂量健康志愿者低、中、高三个剂量组药物半衰期（t1/2）分别为（37441284）h， （465620856）h， （5359221552）h，达峰时间

28、（Tmax）分别为（20882064）h、 （2762016）h、 （24962016）h，峰浓度（Cmax）分别为（608958166）gL1、 （146123707）gL1 和（2950816560944）gL1，药物曲线下面积（AUC0t）分别为（1105196281117）gL1d、 （34569071056242）gL1d、 （82811041996628）gL1d；多剂量肾移植志愿者药物半衰期（t1/2）为（50521702）h，达峰时间（Tmax）为药后（849616368）h，峰浓度（Cmax）为（3316082591894）g/L，曲线下面积 AUC0t 和 AUC0分别为（

29、90108822279616）gL1d 和（94809122584407）gL1d。单剂量健康志愿者三个剂量组抗鼠抗体均产生在用药后第 1014 天，到第 35 天达到高峰，平均最高效价为 1：1600，个体最效价可达 1：3200；8 例肾移植病人用药后仅有 1 例出现抗鼠抗体，其余 7 例至术后第 40 天均未检测到 HAMA。 已建立的两种方法均符合国家对药代动力学研究检测方法学的要求；WuTac 在健康人和肾移植病人的代谢符合线性药代动力学的特征。人白细胞介素 2 受体 链（CD25）特异性地表达于活化的 T 淋巴细胞表面，为T 淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种

30、疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制的抗人 T淋巴细胞 CD25 鼠单克隆抗体（以下简称 WuTac） ，经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入期临床研究。本课题旨在建立人血清中 WuTac 单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照中国药典二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为 WuTac 药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测 WuTac期临床志愿者血样，对 WuTac 的药代动力学特征进行客观准确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。 建立定量检测WuT

31、ac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法并进行方法学验证。用 WuTac 免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry 法对 WuTac 进行精确蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心 ELISA 法兔抗鼠抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体

32、的间接 ELISA 法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac 最佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对 114 份正常人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的 cutoff 值，并对方法的特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种 ELISA 方法分别对 WuTac期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac 单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析 WuTac 在人体中的药代动力学特点。 在定量检测血清 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法中，制备的兔抗鼠血清免疫双扩散效价大于 1：32，纯化后浓度为 77mg/ml，SDSPA

33、GE 法测其纯度大于 90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔抗鼠抗体最佳包被浓度为 0625g/ml，HRP山羊抗鼠最佳稀释度为 1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和酶标抗体稀释液为 20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为 39125ng/ml（rgt;099） 。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml） 、中（625ng/ml） 、低（78ng/ml）三个浓度 WuTac 血样的回收率分别为 10224%、9874%、8944%，5 次测定回收率变异系数（CV 值）分别为 1034%、1091%、606%

34、，重现性良好。测定精密度良好，高中低三个浓度板间精密度分别为 1034%、1091%、606%，板内精密度分别为1002%、1025%、718%。与人血清无交叉反应，高血脂，溶血对检测无影响。在定性检测抗鼠抗体的间接 ELISA 法，WuTac 最佳包被浓度为0313g/ml，最佳血清稀释度为 1：200，HRP山羊抗人最佳稀释度为1：80000，阴阳性判定界值（cutoff 值）为 021，其板内板间变异系数分别为 746%803%和 548%147%，与马，山羊，兔，牛等动物血清无交叉反应。 检测结果表明，单剂量健康志愿者低、中、高三个剂量组药物半衰期（t1/2）分别为（37441284）

35、h， （465620856）h， （5359221552）h，达峰时间（Tmax）分别为（20882064）h、 （2762016）h、 （24962016）h，峰浓度（Cmax）分别为（608958166）gL1、 （146123707）gL1 和（2950816560944）gL1，药物曲线下面积（AUC0t）分别为（1105196281117）gL1d、 （34569071056242）gL1d、 （82811041996628）gL1d；多剂量肾移植志愿者药物半衰期（t1/2）为（50521702）h，达峰时间（Tmax）为药后（849616368）h，峰浓度（Cmax）为（33160

36、82591894）g/L，曲线下面积 AUC0t 和 AUC0分别为（90108822279616）gL1d 和（94809122584407）gL1d。单剂量健康志愿者三个剂量组抗鼠抗体均产生在用药后第 1014 天，到第 35 天达到高峰，平均最高效价为 1：1600，个体最效价可达 1：3200；8 例肾移植病人用药后仅有 1 例出现抗鼠抗体，其余 7 例至术后第 40 天均未检测到 HAMA。 已建立的两种方法均符合国家对药代动力学研究检测方法学的要求；WuTac 在健康人和肾移植病人的代谢符合线性药代动力学的特征。人白细胞介素 2 受体 链（CD25）特异性地表达于活化的 T 淋巴细

37、胞表面，为T 淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制的抗人 T淋巴细胞 CD25 鼠单克隆抗体（以下简称 WuTac） ，经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入期临床研究。本课题旨在建立人血清中 WuTac 单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照中国药典二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为 WuTac 药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测 WuTac期临床志愿者血样，对 WuTac 的药代动力学特征进行客观准

38、确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。 建立定量检测WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法并进行方法学验证。用 WuTac 免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry 法对 WuTac 进行精确蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心 ELISA 法兔抗鼠抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对

39、样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体的间接 ELISA 法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac 最佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对 114 份正常人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的 cutoff 值，并对方法的特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种 ELISA 方法分别对 WuTac期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac 单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析 WuTac 在人体中的药代动力学特点。 在定量检测血清 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法中，制备的兔抗鼠血清

40、免疫双扩散效价大于 1：32，纯化后浓度为 77mg/ml，SDSPAGE 法测其纯度大于 90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔抗鼠抗体最佳包被浓度为 0625g/ml，HRP山羊抗鼠最佳稀释度为 1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和酶标抗体稀释液为 20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为 39125ng/ml（rgt;099） 。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml） 、中（625ng/ml） 、低（78ng/ml）三个浓度 WuTac 血样的回收率分别为 10224%、9874%、8944%，5 次

41、测定回收率变异系数（CV 值）分别为 1034%、1091%、606%，重现性良好。测定精密度良好，高中低三个浓度板间精密度分别为 1034%、1091%、606%，板内精密度分别为1002%、1025%、718%。与人血清无交叉反应，高血脂，溶血对检测无影响。在定性检测抗鼠抗体的间接 ELISA 法，WuTac 最佳包被浓度为0313g/ml，最佳血清稀释度为 1：200，HRP山羊抗人最佳稀释度为1：80000，阴阳性判定界值（cutoff 值）为 021，其板内板间变异系数分别为 746%803%和 548%147%，与马，山羊，兔，牛等动物血清无交叉反应。 检测结果表明，单剂量健康志愿

42、者低、中、高三个剂量组药物半衰期（t1/2）分别为（37441284）h， （465620856）h， （5359221552）h，达峰时间（Tmax）分别为（20882064）h、 （2762016）h、 （24962016）h，峰浓度（Cmax）分别为（608958166）gL1、 （146123707）gL1 和（2950816560944）gL1，药物曲线下面积（AUC0t）分别为（1105196281117）gL1d、 （34569071056242）gL1d、 （82811041996628）gL1d；多剂量肾移植志愿者药物半衰期（t1/2）为（50521702）h，达峰时间（Tm

43、ax）为药后（849616368）h，峰浓度（Cmax）为（3316082591894）g/L，曲线下面积 AUC0t 和 AUC0分别为（90108822279616）gL1d 和（94809122584407）gL1d。单剂量健康志愿者三个剂量组抗鼠抗体均产生在用药后第 1014 天，到第 35 天达到高峰，平均最高效价为 1：1600，个体最效价可达 1：3200；8 例肾移植病人用药后仅有 1 例出现抗鼠抗体，其余 7 例至术后第 40 天均未检测到 HAMA。 已建立的两种方法均符合国家对药代动力学研究检测方法学的要求；WuTac 在健康人和肾移植病人的代谢符合线性药代动力学的特征。

44、人白细胞介素 2 受体 链（CD25）特异性地表达于活化的 T 淋巴细胞表面，为T 淋巴细胞克隆增殖及其维护活性的必需跨膜蛋白，是临床上多种疾病（如移植排斥反应，自身免疫性疾病等）治疗的重要靶点。由我所自主研制的抗人 T淋巴细胞 CD25 鼠单克隆抗体（以下简称 WuTac） ，经国家食品药品监督管理局（SFDA）批准已进入期临床研究。本课题旨在建立人血清中 WuTac 单抗浓度和抗鼠抗体的检测方法，并按照中国药典二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”和“生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则”的要求进行方法学验证，为 WuTac 药代动力学研究提供可靠的检测方法，在此基础上通过检测

45、WuTac期临床志愿者血样，对 WuTac 的药代动力学特征进行客观准确评价，为后期临床试验给药方案的设计提供科学依据。 建立定量检测WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法并进行方法学验证。用 WuTac 免疫新西兰白兔，免疫双扩散法测定效价达到要求后收集全血，分离血清，辛酸硫酸铵法对抗血清进行纯化。Lowry 法对 WuTac 进行精确蛋白定量，制备检测参考标准品。通过棋盘滴定选择了双抗体夹心 ELISA 法兔抗鼠抗体的最佳包被浓度和最佳酶标二抗稀释度，并对酶标板，封闭剂，酶标二抗稀释液等试验条件进行了优化，确定了线性检测范围。对建立的方法进行方法学验证，通过回收试验测定高中低浓度

46、血样评价其准确度，重复试验确定其精密度，考察了其特异性及交叉反应，并对样品在不同温度条件下存放的稳定性进行测定。建立定性检测人血清人抗鼠抗体的间接 ELISA 法并进行方法学验证。通过棋盘滴定确定WuTac 最佳包被浓度，血清稀释度和酶标二抗稀释度，通过用该方法对 114 份正常人血浆进行人抗鼠抗体检测，确定了该方法的 cutoff 值，并对方法的特异性，精密性等特性进行了验证。用所建立的两种 ELISA 方法分别对 WuTac期临床试验中单剂量健康志愿者和多剂量肾移植志愿者不同时间点血清中WuTac 单抗浓度和人抗鼠抗体进行了检测，分析 WuTac 在人体中的药代动力学特点。 在定量检测血清

47、 WuTac 单抗浓度的双抗体夹心 ELISA 法中，制备的兔抗鼠血清免疫双扩散效价大于 1：32，纯化后浓度为 77mg/ml，SDSPAGE 法测其纯度大于 90%，符合包被用抗原的要求。棋盘滴定方法确定兔抗鼠抗体最佳包被浓度为 0625g/ml，HRP山羊抗鼠最佳稀释度为 1：20000，最佳固相载体为国产深圳金灿华生产的酶标板，最佳封闭剂和酶标抗体稀释液为 20%山羊血清。采用半对数回归分析，该方法的定量线性范围为 39125ng/ml（rgt;099） 。方法学验证表明，测定回收率（准确度）良好，高（100ng/ml） 、中（625ng/ml） 、低（78ng/ml）三个浓度 WuTac 血样的回收率分别为 10224%、9874%、8944%，5 次测定回收率变异系数（CV 值）分别为 1034%、1091%、606%，重现性良好。测定精密度良好，高中低