1、病原生物学专业毕业论文 精品论文 HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合核酸疫苗免疫保护作用的研究关键词：多表位 人乳头瘤病毒 沙眼衣原体 主要外膜蛋白 免疫保护 胞内细胞因子摘要：目的： 1制备 pcDNA3.1/HPV6b L1/Ct MOMP人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b 型晚期蛋白 1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia trachomatis，Ct，major outer membrane protein，MOMP)多表位嵌合质粒； 2建立小鼠生殖道 Ct感染模型； 3研究 HPV6b L1/Ct MOMP 多表位嵌合核酸疫苗(简称
2、为：HPV6bL1/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道 Ct感染的保护作用。 方法： 1采用 QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组质粒，同时提取 pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用 QIAGEN镍合胶制备 pET32a/ CtMOMP168蛋白在 Prime-boost免疫时使用； 2采用 Hep-2细胞培养 E血清型 Ct(ATCC VR-348B Trachoma serotype E)并进行 Ct包涵体的鉴定以及 Ct纯化； 3小鼠生殖道 Ct感染模型的建立：以 106包涵
3、体形成单位(Inclusion forming units，IFU)剂量的 Ct原体(Elementary body，EB)感染 BALB/c小鼠生殖道，同时 Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染 Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物 PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定 Ct IFU等证实模型是否构建成功； 4选择 6-8周 BALB/c雌性小鼠，用 pcDNA3.1(+)/ HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸免疫。同时设 PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和 Prime-boost免疫策略组对照(第 1次先用 pcDNA3.
4、1(+)/HPV6bL1/ CtMOMP168 核酸免疫，之后两次免疫用 pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采用 0、2、4 周肌肉注射免疫，共免疫 3次；末次免疫后第 2周用 106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR 鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测 IgG。初次免疫后第 8周取小鼠脾淋巴细胞检测其 CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子 IFN-，IL-4，IL-10 的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道 Ct清除率等指标来判定重组质粒组对
5、小鼠生殖道感染 Ct的保护效果。 结果： 1经 Lugos碘液染色法进行鉴定，证实 Ct培养成功，为建立生殖道感染模型和检测 Ct奠定了实验基础； 2提取阴道分泌物DNA进行 PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数 Ct IFU从而检测 Ct清除率和组织病理切片证实 106IFU Ct剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模型；3 ELISA结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 免疫组能刺激机体产生抗 Ct全菌体的特异性 IgG和 sIgA；攻击前后比较(第 6周进行 Ct攻击，取第 5周和第 7周作为攻击前后对比)：经 Ct攻击后 1周就能够有效诱发再次免疫应
6、答，血清 IgG抗体(A490 读数)均值分别为：0.6690.058 和0.9510.038(T=2.77，p=0.008)。阴道分泌物 sIgA第 5周、7 周比较：0.04010.045和 0.5420.040(T=2.17，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组IgG抗体均值第 5周、7 周分别为：0.8520.058 和1.2310.032(T=2.78，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.04)。sIgA 第 5周、7周分别为：0.5230.027
7、和 0.7810.052(T=2.78，p=0.001)Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.001)。CTL 细胞活性检测结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168组免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为 46.40，与对照组比较具有显著性差异(plt;0.05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的 IFN-，而 IL-4和 IL-10升高不明显，具有显著性差异(plt;0.05)。小鼠外生殖道外观显示疫苗组炎
8、症明显减轻，生殖道 Ct清除率明显升高。以上结果提示，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组疫苗以及利用 Prime-boost免疫策略对小鼠 Ct生殖道感染具有一定的免疫保护效果。 结论： 1成功培养并纯化了 Ct； 2建立了稳定的小鼠 Ct生殖道感染模型； 3证实了 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸疫苗组和 Prime-boost策略组均可针对小鼠生殖道 Ct感染产生一定的免疫保护效应。正文内容目的： 1制备 pcDNA3.1/HPV6b L1/Ct MOMP人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b
9、型晚期蛋白 1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia trachomatis，Ct，major outer membrane protein，MOMP)多表位嵌合质粒； 2建立小鼠生殖道 Ct感染模型； 3研究 HPV6b L1/Ct MOMP 多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bL1/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道 Ct感染的保护作用。 方法： 1采用 QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组质粒，同时提取 pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用 QIAGEN镍合胶制备 p
10、ET32a/ CtMOMP168蛋白在 Prime-boost免疫时使用； 2采用 Hep-2细胞培养 E血清型 Ct(ATCC VR-348B Trachoma serotype E)并进行 Ct包涵体的鉴定以及 Ct纯化； 3小鼠生殖道 Ct感染模型的建立：以 106包涵体形成单位(Inclusion forming units，IFU)剂量的 Ct原体(Elementary body，EB)感染 BALB/c小鼠生殖道，同时 Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染 Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物 PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定 Ct IFU等证实模型是否构建成
11、功； 4选择 6-8周 BALB/c雌性小鼠，用 pcDNA3.1(+)/ HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸免疫。同时设 PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和 Prime-boost免疫策略组对照(第 1次先用 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/ CtMOMP168 核酸免疫，之后两次免疫用 pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采用 0、2、4 周肌肉注射免疫，共免疫 3次；末次免疫后第 2周用 106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR 鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测 Ig
12、G。初次免疫后第 8周取小鼠脾淋巴细胞检测其 CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子 IFN-，IL-4，IL-10 的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道 Ct清除率等指标来判定重组质粒组对小鼠生殖道感染 Ct的保护效果。 结果： 1经 Lugos碘液染色法进行鉴定，证实 Ct培养成功，为建立生殖道感染模型和检测 Ct奠定了实验基础； 2提取阴道分泌物DNA进行 PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数 Ct IFU从而检测 Ct清除率和组织病理切片证实 106IFU Ct剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模
13、型；3 ELISA结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 免疫组能刺激机体产生抗 Ct全菌体的特异性 IgG和 sIgA；攻击前后比较(第 6周进行 Ct攻击，取第 5周和第 7周作为攻击前后对比)：经 Ct攻击后 1周就能够有效诱发再次免疫应答，血清 IgG抗体(A490 读数)均值分别为：0.6690.058 和0.9510.038(T=2.77，p=0.008)。阴道分泌物 sIgA第 5周、7 周比较：0.04010.045和 0.5420.040(T=2.17，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组IgG抗体均值第 5周、7 周分别为：0
14、.8520.058 和1.2310.032(T=2.78，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.04)。sIgA 第 5周、7周分别为：0.5230.027 和 0.7810.052(T=2.78，p=0.001)Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.001)。CTL 细胞活性检测结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168组免疫后能产生对靶细胞的特异性
15、杀伤活性均值为 46.40，与对照组比较具有显著性差异(plt;0.05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的 IFN-，而 IL-4和 IL-10升高不明显，具有显著性差异(plt;0.05)。小鼠外生殖道外观显示疫苗组炎症明显减轻，生殖道 Ct清除率明显升高。以上结果提示，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组疫苗以及利用 Prime-boost免疫策略对小鼠 Ct生殖道感染具有一定的免疫保护效果。 结论： 1成功培养并纯化了 Ct； 2建立了稳定的小鼠 Ct生殖道感染模型； 3证实了 pcDNA3.1(+)/H
16、PV6bL1/Ct MOMP168 核酸疫苗组和 Prime-boost策略组均可针对小鼠生殖道 Ct感染产生一定的免疫保护效应。目的： 1制备 pcDNA3.1/HPV6b L1/Ct MOMP人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b 型晚期蛋白 1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia trachomatis，Ct，major outer membrane protein，MOMP)多表位嵌合质粒； 2建立小鼠生殖道 Ct感染模型； 3研究 HPV6b L1/Ct MOMP 多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bL1/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道
17、 Ct感染的保护作用。 方法： 1采用 QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组质粒，同时提取 pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用 QIAGEN镍合胶制备 pET32a/ CtMOMP168蛋白在 Prime-boost免疫时使用； 2采用 Hep-2细胞培养 E血清型 Ct(ATCC VR-348B Trachoma serotype E)并进行 Ct包涵体的鉴定以及 Ct纯化； 3小鼠生殖道 Ct感染模型的建立：以 106包涵体形成单位(Inclusion forming unit
18、s，IFU)剂量的 Ct原体(Elementary body，EB)感染 BALB/c小鼠生殖道，同时 Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染 Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物 PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定 Ct IFU等证实模型是否构建成功； 4选择 6-8周 BALB/c雌性小鼠，用 pcDNA3.1(+)/ HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸免疫。同时设 PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和 Prime-boost免疫策略组对照(第 1次先用 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/ CtMOMP168 核酸免疫
19、，之后两次免疫用 pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采用 0、2、4 周肌肉注射免疫，共免疫 3次；末次免疫后第 2周用 106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR 鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测 IgG。初次免疫后第 8周取小鼠脾淋巴细胞检测其 CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子 IFN-，IL-4，IL-10 的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道 Ct清除率等指标来判定重组质粒组对小鼠生殖道感染 Ct的保护效果。 结果： 1经 Lugo
20、s碘液染色法进行鉴定，证实 Ct培养成功，为建立生殖道感染模型和检测 Ct奠定了实验基础； 2提取阴道分泌物DNA进行 PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数 Ct IFU从而检测 Ct清除率和组织病理切片证实 106IFU Ct剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模型；3 ELISA结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 免疫组能刺激机体产生抗 Ct全菌体的特异性 IgG和 sIgA；攻击前后比较(第 6周进行 Ct攻击，取第 5周和第 7周作为攻击前后对比)：经 Ct攻击后 1周就能够有效诱发再次免疫应答，血清 IgG抗体(A490 读数)均值分别为：0.6
21、690.058 和0.9510.038(T=2.77，p=0.008)。阴道分泌物 sIgA第 5周、7 周比较：0.04010.045和 0.5420.040(T=2.17，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组IgG抗体均值第 5周、7 周分别为：0.8520.058 和1.2310.032(T=2.78，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.04)。sIgA 第 5周、7周分别为：0.5230.027 和 0.7810.052(T=2.78，p=0.001)
22、Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.001)。CTL 细胞活性检测结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168组免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为 46.40，与对照组比较具有显著性差异(plt;0.05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的 IFN-，而 IL-4和 IL-10升高不明显，具有显著性差异(plt;0.05)。小鼠外生殖道外观显示疫苗组炎症明显减轻，生殖道 Ct清除率明显升高。以上结果提示，p
23、cDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组疫苗以及利用 Prime-boost免疫策略对小鼠 Ct生殖道感染具有一定的免疫保护效果。 结论： 1成功培养并纯化了 Ct； 2建立了稳定的小鼠 Ct生殖道感染模型； 3证实了 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸疫苗组和 Prime-boost策略组均可针对小鼠生殖道 Ct感染产生一定的免疫保护效应。目的： 1制备 pcDNA3.1/HPV6b L1/Ct MOMP人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b 型晚期蛋白 1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia tr
24、achomatis，Ct，major outer membrane protein，MOMP)多表位嵌合质粒； 2建立小鼠生殖道 Ct感染模型； 3研究 HPV6b L1/Ct MOMP 多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bL1/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道 Ct感染的保护作用。 方法： 1采用 QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组质粒，同时提取 pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用 QIAGEN镍合胶制备 pET32a/ CtMOMP168蛋白在 Prime-boost免
25、疫时使用； 2采用 Hep-2细胞培养 E血清型 Ct(ATCC VR-348B Trachoma serotype E)并进行 Ct包涵体的鉴定以及 Ct纯化； 3小鼠生殖道 Ct感染模型的建立：以 106包涵体形成单位(Inclusion forming units，IFU)剂量的 Ct原体(Elementary body，EB)感染 BALB/c小鼠生殖道，同时 Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染 Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物 PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定 Ct IFU等证实模型是否构建成功； 4选择 6-8周 BALB/c雌性小鼠，用 pcDNA3.
26、1(+)/ HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸免疫。同时设 PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和 Prime-boost免疫策略组对照(第 1次先用 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/ CtMOMP168 核酸免疫，之后两次免疫用 pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采用 0、2、4 周肌肉注射免疫，共免疫 3次；末次免疫后第 2周用 106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR 鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测 IgG。初次免疫后第 8周取小鼠脾淋巴细胞检测其 CTL(Cytot
27、oxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子 IFN-，IL-4，IL-10 的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道 Ct清除率等指标来判定重组质粒组对小鼠生殖道感染 Ct的保护效果。 结果： 1经 Lugos碘液染色法进行鉴定，证实 Ct培养成功，为建立生殖道感染模型和检测 Ct奠定了实验基础； 2提取阴道分泌物DNA进行 PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数 Ct IFU从而检测 Ct清除率和组织病理切片证实 106IFU Ct剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模型；3 ELISA结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL
28、1/Ct MOMP168 免疫组能刺激机体产生抗 Ct全菌体的特异性 IgG和 sIgA；攻击前后比较(第 6周进行 Ct攻击，取第 5周和第 7周作为攻击前后对比)：经 Ct攻击后 1周就能够有效诱发再次免疫应答，血清 IgG抗体(A490 读数)均值分别为：0.6690.058 和0.9510.038(T=2.77，p=0.008)。阴道分泌物 sIgA第 5周、7 周比较：0.04010.045和 0.5420.040(T=2.17，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组IgG抗体均值第 5周、7 周分别为：0.8520.058 和1.2310.032(T=2.78，p=0
29、.001)。Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.04)。sIgA 第 5周、7周分别为：0.5230.027 和 0.7810.052(T=2.78，p=0.001)Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.001)。CTL 细胞活性检测结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168组免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为 46.40，与对照组比较具有显著性差异(plt;
30、0.05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的 IFN-，而 IL-4和 IL-10升高不明显，具有显著性差异(plt;0.05)。小鼠外生殖道外观显示疫苗组炎症明显减轻，生殖道 Ct清除率明显升高。以上结果提示，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组疫苗以及利用 Prime-boost免疫策略对小鼠 Ct生殖道感染具有一定的免疫保护效果。 结论： 1成功培养并纯化了 Ct； 2建立了稳定的小鼠 Ct生殖道感染模型； 3证实了 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸疫苗组和 Prime-b
31、oost策略组均可针对小鼠生殖道 Ct感染产生一定的免疫保护效应。目的： 1制备 pcDNA3.1/HPV6b L1/Ct MOMP人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b 型晚期蛋白 1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia trachomatis，Ct，major outer membrane protein，MOMP)多表位嵌合质粒； 2建立小鼠生殖道 Ct感染模型； 3研究 HPV6b L1/Ct MOMP 多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bL1/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道 Ct感染的保护作用。 方法： 1采用 QIAGEN质粒大量提取
32、试剂盒提取 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组质粒，同时提取 pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用 QIAGEN镍合胶制备 pET32a/ CtMOMP168蛋白在 Prime-boost免疫时使用； 2采用 Hep-2细胞培养 E血清型 Ct(ATCC VR-348B Trachoma serotype E)并进行 Ct包涵体的鉴定以及 Ct纯化； 3小鼠生殖道 Ct感染模型的建立：以 106包涵体形成单位(Inclusion forming units，IFU)剂量的 Ct原体(Elementary body，E
33、B)感染 BALB/c小鼠生殖道，同时 Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染 Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物 PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定 Ct IFU等证实模型是否构建成功； 4选择 6-8周 BALB/c雌性小鼠，用 pcDNA3.1(+)/ HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸免疫。同时设 PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和 Prime-boost免疫策略组对照(第 1次先用 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/ CtMOMP168 核酸免疫，之后两次免疫用 pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采
34、用 0、2、4 周肌肉注射免疫，共免疫 3次；末次免疫后第 2周用 106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR 鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测 IgG。初次免疫后第 8周取小鼠脾淋巴细胞检测其 CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子 IFN-，IL-4，IL-10 的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道 Ct清除率等指标来判定重组质粒组对小鼠生殖道感染 Ct的保护效果。 结果： 1经 Lugos碘液染色法进行鉴定，证实 Ct培养成功，为建立生殖道感染模型和
35、检测 Ct奠定了实验基础； 2提取阴道分泌物DNA进行 PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数 Ct IFU从而检测 Ct清除率和组织病理切片证实 106IFU Ct剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模型；3 ELISA结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 免疫组能刺激机体产生抗 Ct全菌体的特异性 IgG和 sIgA；攻击前后比较(第 6周进行 Ct攻击，取第 5周和第 7周作为攻击前后对比)：经 Ct攻击后 1周就能够有效诱发再次免疫应答，血清 IgG抗体(A490 读数)均值分别为：0.6690.058 和0.9510.038(T=2.77，p=0.0
36、08)。阴道分泌物 sIgA第 5周、7 周比较：0.04010.045和 0.5420.040(T=2.17，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组IgG抗体均值第 5周、7 周分别为：0.8520.058 和1.2310.032(T=2.78，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.04)。sIgA 第 5周、7周分别为：0.5230.027 和 0.7810.052(T=2.78，p=0.001)Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/H
37、PV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.001)。CTL 细胞活性检测结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168组免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为 46.40，与对照组比较具有显著性差异(plt;0.05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的 IFN-，而 IL-4和 IL-10升高不明显，具有显著性差异(plt;0.05)。小鼠外生殖道外观显示疫苗组炎症明显减轻，生殖道 Ct清除率明显升高。以上结果提示，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组疫
38、苗以及利用 Prime-boost免疫策略对小鼠 Ct生殖道感染具有一定的免疫保护效果。 结论： 1成功培养并纯化了 Ct； 2建立了稳定的小鼠 Ct生殖道感染模型； 3证实了 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸疫苗组和 Prime-boost策略组均可针对小鼠生殖道 Ct感染产生一定的免疫保护效应。目的： 1制备 pcDNA3.1/HPV6b L1/Ct MOMP人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b 型晚期蛋白 1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia trachomatis，Ct，major outer membran
39、e protein，MOMP)多表位嵌合质粒； 2建立小鼠生殖道 Ct感染模型； 3研究 HPV6b L1/Ct MOMP 多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bL1/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道 Ct感染的保护作用。 方法： 1采用 QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组质粒，同时提取 pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用 QIAGEN镍合胶制备 pET32a/ CtMOMP168蛋白在 Prime-boost免疫时使用； 2采用 Hep-2细胞培养 E血清型 Ct(ATCC
40、 VR-348B Trachoma serotype E)并进行 Ct包涵体的鉴定以及 Ct纯化； 3小鼠生殖道 Ct感染模型的建立：以 106包涵体形成单位(Inclusion forming units，IFU)剂量的 Ct原体(Elementary body，EB)感染 BALB/c小鼠生殖道，同时 Hep-2细胞感染另一组小鼠作为阴性对照。小鼠感染 Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物 PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定 Ct IFU等证实模型是否构建成功； 4选择 6-8周 BALB/c雌性小鼠，用 pcDNA3.1(+)/ HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸免疫。同时
41、设 PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和 Prime-boost免疫策略组对照(第 1次先用 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/ CtMOMP168 核酸免疫，之后两次免疫用 pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采用 0、2、4 周肌肉注射免疫，共免疫 3次；末次免疫后第 2周用 106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR 鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测 IgG。初次免疫后第 8周取小鼠脾淋巴细胞检测其 CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流
42、式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子 IFN-，IL-4，IL-10 的分泌。并通过观察小鼠生殖道炎症和检测生殖道 Ct清除率等指标来判定重组质粒组对小鼠生殖道感染 Ct的保护效果。 结果： 1经 Lugos碘液染色法进行鉴定，证实 Ct培养成功，为建立生殖道感染模型和检测 Ct奠定了实验基础； 2提取阴道分泌物DNA进行 PCR鉴定、阴道分泌物细胞培养计数 Ct IFU从而检测 Ct清除率和组织病理切片证实 106IFU Ct剂量感染小鼠可以建立稳定的小鼠生殖道感染模型；3 ELISA结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 免疫组能刺激机体产生抗 Ct全菌体的特
43、异性 IgG和 sIgA；攻击前后比较(第 6周进行 Ct攻击，取第 5周和第 7周作为攻击前后对比)：经 Ct攻击后 1周就能够有效诱发再次免疫应答，血清 IgG抗体(A490 读数)均值分别为：0.6690.058 和0.9510.038(T=2.77，p=0.008)。阴道分泌物 sIgA第 5周、7 周比较：0.04010.045和 0.5420.040(T=2.17，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组IgG抗体均值第 5周、7 周分别为：0.8520.058 和1.2310.032(T=2.78，p=0.001)。Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.
44、1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.04)。sIgA 第 5周、7周分别为：0.5230.027 和 0.7810.052(T=2.78，p=0.001)Prime-boost 免疫策略组与 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 组有显著性差异(T=2.77，p=0.001)。CTL 细胞活性检测结果显示 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168组免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤活性均值为 46.40，与对照组比较具有显著性差异(plt;0.05)。流式细胞术(FCM)检测脾细胞胞内细胞因子结果显示，
45、免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的 IFN-，而 IL-4和 IL-10升高不明显，具有显著性差异(plt;0.05)。小鼠外生殖道外观显示疫苗组炎症明显减轻，生殖道 Ct清除率明显升高。以上结果提示，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP168 重组疫苗以及利用 Prime-boost免疫策略对小鼠 Ct生殖道感染具有一定的免疫保护效果。 结论： 1成功培养并纯化了 Ct； 2建立了稳定的小鼠 Ct生殖道感染模型； 3证实了 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸疫苗组和 Prime-boost策略组均可针对小鼠生殖道 Ct感染产生一定的免疫保护效应
46、。目的： 1制备 pcDNA3.1/HPV6b L1/Ct MOMP人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)6b 型晚期蛋白 1/沙眼衣原体主要外膜蛋白(Chlamydia trachomatis，Ct，major outer membrane protein，MOMP)多表位嵌合质粒； 2建立小鼠生殖道 Ct感染模型； 3研究 HPV6b L1/Ct MOMP 多表位嵌合核酸疫苗(简称为：HPV6bL1/CtMOMP168)免疫对小鼠生殖道 Ct感染的保护作用。 方法： 1采用 QIAGEN质粒大量提取试剂盒提取 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CtMOMP
47、168 重组质粒，同时提取 pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168DNA作为实验对照。并利用 QIAGEN镍合胶制备 pET32a/ CtMOMP168蛋白在 Prime-boost免疫时使用； 2采用 Hep-2细胞培养 E血清型 Ct(ATCC VR-348B Trachoma serotype E)并进行 Ct包涵体的鉴定以及 Ct纯化； 3小鼠生殖道 Ct感染模型的建立：以 106包涵体形成单位(Inclusion forming units，IFU)剂量的 Ct原体(Elementary body，EB)感染 BALB/c小鼠生殖道，同时 Hep-2细胞感染另一组
48、小鼠作为阴性对照。小鼠感染 Ct后，通过外生殖道炎症观察、阴道分泌物 PCR鉴定、阴道分泌物做细胞培养鉴定 Ct IFU等证实模型是否构建成功； 4选择 6-8周 BALB/c雌性小鼠，用 pcDNA3.1(+)/ HPV6bL1/Ct MOMP168 核酸免疫。同时设 PBS、pcDNA3.1、pcDNA3.1/ Ct MOMP168作为对照和 Prime-boost免疫策略组对照(第 1次先用 pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/ CtMOMP168 核酸免疫，之后两次免疫用 pET32a/ Ct MOMP168蛋白)，采用 0、2、4 周肌肉注射免疫，共免疫 3次；末次免疫后第 2周用 106 IFU Ct EBs进行攻击小鼠生殖道。隔周采集阴道分泌物进行细胞培养、PCR 鉴定以及sIgA检测，断尾取血分离血清检测 IgG。初次免疫后第 8周取小鼠脾淋巴细胞检测其 CTL(Cytotoxcity T lymphocytes，CTL)的杀伤活性和流式细胞术分析脾淋巴细胞胞内细胞因子 IFN-，IL-4，IL-10 的分泌
