1、神经外科学专业优秀论文 Feridex 标记 BMSCs 经尾静脉注射移植治疗 MCAO 大鼠及 MRI 示踪的实验研究关键词：缺血性脑卒中 骨髓基质细胞 经尾静脉注射 移植治疗 Feridex 标记 MRI 示踪摘要：脑血管病已经成为人类致死致残最主要的原因之一，其发病率有逐年上升的趋势，其中以缺血性脑卒中最常见。神经干细胞的发现和分离成功打破了神经组织损伤不能再生的传统观念。目前国内外相关研究大多将骨髓基质细胞直接移植到脑缺血区域，获得了令人振奋的治疗效果。通过立体定向或者开颅直接注射入损伤部位或者直接注射入脑室脑池，能将 BMSCs 直接送达受损部位，提高移植物抵达靶点的数量。因开创性手
2、术对脑组织产生一定的损伤；不便多次多靶点注射；同时也存在无菌性蛛网膜炎和蛛网膜下腔粘连的危险。本研究选择经尾静脉注入骨髓基质细胞，简便、安全、快捷，一次可以输入较多数量的 BMSCs，进入脑内的 BMSCs 分布在缺血坏死灶周边区。本研究主要解决的问题是 BMSCs 经尾静脉注射移植后，如何在活体内检测移植细胞的定向归巢和细胞增殖。本研究方法是使用活体示踪剂超顺磁性氧化铁颗粒 Feridex（商品名：菲立磁）在磁共振下体内外观察被标记的 BMSCs，监测 BMSCs 在脑内存活、增殖和向神经分化，分析对 MCAO 大鼠的神经功能评分改变的影响，评价经静脉注射移植 BMSCs 以及 Feride
3、x 标记 BMSCs 的可行性。 第一部分 大鼠骨髓基质细胞的体外培养实验研究 目的：探索大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的体外培养方法。 方法：体外分离 6090 g SD（SpragueDawley）大鼠骨髓，贴壁法扩增培养大鼠 BMSCs，相差显微镜观察原代及不同传代细胞的生长特性及形态变化，并进行细胞表型鉴定和巢蛋白（nestin） 、神经元特异性核蛋白（Neuronal specific neucleoprotein，NeuN） 、胶质原纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）免疫细胞化
4、学鉴定。 结果：培养的 BMSCs 传代 12 小时后贴壁率高达 95%，在第 3 代纯度可达到 92%。大鼠 BMSCs 经分离纯化并传代后能表达 nestin、NeuN、GFAP 等特异性标记物，传到第 3 代后镜下 nestin 阳性细胞率为 80.1%，GFAP 阳性细胞率为 28.7%，NeuN 阳性细胞率为 14.5%。 结论：传 3 代的细胞可作为理想细胞移植治疗的细胞来源。 第二部分 Feridex 标记骨髓基质细胞体外实验研究 目的：应用超顺磁性氧化铁 Feridex 和阳离子转染试剂多聚赖氨酸（PLL）复合物 FeridexPLL 体外标记大鼠骨髓基质细胞（BMSCs） ，
5、初步评价磁共振成像示踪 Feridex 标记 BMSCs 的可行性。 方法：体外分离 6090 g SD 大鼠骨髓，贴壁法扩增培养大鼠 BMSCs，并用 FeridexPLL 体外标记，用普鲁士蓝染色和台盼兰排斥试验鉴定细胞内铁以及标记细胞的活性；利用 MRI 不同序列快速自旋回波（TSE）脉冲序列 TSET1WI、TSET2WI、FFET2WI 分别对 FeridexPLL 标记后 BMSCs 和未标记 BMSCs 按1105、5105、6105 不同细胞数量进行成像，分析其信号强度值和强度变化率（ASI）与不同序列、标记情况和标记细胞数量的关系。 结果：FeridexPLL 对 BMSCs
6、 体外标记率近 100%，对细胞形态和活性无明显影响。未标记细胞在 TSET1WI、TSET2WI 与 FFET2WI 之间的信号强度无统计学差异。细胞标记与不标记间的 MRI 各序列信号强度之间差异显著（Plt;0.001） ，前者随着细胞数量的增加而增强。各序列信号强度测量值在细胞是否标记与标记细胞数量之间交互效应较大。3 个序列中以 FFET2WI 的信号强度变化率（ASI）最大，对磁标记细胞的显示最为敏感。在各成像序列上不同标记数量的细胞与未标记细胞之间的信号强度显示明显的统计学差异（Plt;0.001） 。各序列 ASI 在细胞是否标记与标记细胞数量之间有较小的交互效应。 结论：MR
7、I 成像显示标记后 1105 个细胞即可引起明显的信号改变，FFET2WI 序列最为敏感，信号强度与细胞数量明显相关，非常适用于 BMSCs 体内外的示踪研究。FeridexPLL 是 BMSCs 比较理想的示踪剂，标记率高。 第三部分 线栓法制备 MCAO 大鼠模型 目的：用线栓法制作 SD 大鼠大脑中动脉梗塞（MCAO）模型，方法简单、易行、梗塞范围恒定、模型稳定。 方法：选用健康、成年雄性清洁级 SD 大鼠 100 只，用线栓法堵塞大脑中动脉 2h，再灌注后 3d 内ZeaLonga 评分 23 分为成功模型。模型制造后 3d、7d 通过神经功能缺损严重程度评分（modified Neu
8、rological Severity Scores，NSS）和横木行走实验（Beam walking Test，BWT）评分观察其行为学改变，同时行 MRI 检查了解各序列梗塞病灶变化情况，再灌注后 7d 断头取脑，进行 TTC 染色及 HE 染色观察梗塞情况。 结果：技术未成熟时模型制备再灌注 24 小时内模型成功率为52%，3 日内模型成功率为 35%。后期模型制备的 28 只老鼠 3 日内成功率 75%，死亡率和失败率均低。35 只成功大鼠模型的行为学评分：缺血再灌注后 3 天NSS7.632.613 分，7 天 NSS6.972.760 分，二者的有显著的统计学差异（P=0.006）
9、；缺血再灌注后 3 天 BWT 评分 5.231.864 分，7 天BWT5.032.062 分，二者无统计学差异（P=0.393） 。成功模型 MRI 扫描可见大鼠脑组织水肿明显，T2WI 示显著高信号，一周时水肿达高峰期；动态观察水肿程度随时间呈不同程度缓解；T2WI 信号递减，以梗塞周边区明显。TTC 染色见梗塞病灶范围基本恒定。 结论：技术成熟后，线栓法可制备稳定的 MCAO 大鼠模型，能作为脑梗塞实验研究的模型。 第四部分 Feridex 标记 BMSCs 经尾静脉注射移植治疗 MCAO 大鼠及 MRI 示踪 目的：评估核磁共振示踪观察Feridex 标记移植后 BMSCs 存活、定
10、向归巢能力和分化的效果。 方法：选用健康、成年雄性清洁级 SD 大鼠 100 只，随机分成经尾静脉注射移植治疗组（SPIOBrdUBMSCs 移植组，细胞数 3106，20 只） 、梗塞对照组（梗塞后SPIOPLL 单独注射，20 只） 、假手术移植组（SPIOBrdUBMSCs 移植，细胞数 3106，20 只） 、空白对照组（正常大鼠经尾静脉注射等容量 PBS，20 只） 、经颈动脉注射移植治疗组（SPIOBrdUBMSCs 移植组，细胞数 2106，20 只）。缺血再灌注后 7d 经静脉或者动脉注射，按注射后处死时间3d、7d、14d、28d 分成亚组，每亚组均为 5 只大鼠。经尾静脉或
11、者颈动脉注射移植 FeridexPLL 和 5溴脱氧尿核苷（5bromodeoxyuridine，BrdU）双标记的 BMSCs 或者经尾静脉注射 FeridexPLL、PBS，在各时相点分别进行大鼠行为学评分、MRI 各序列信号观察、取脑组织石蜡切片后进行普鲁士蓝染色及免疫组化染色、免疫双标共聚焦观测。 结果：经尾静脉细胞移植后 MCAO 大鼠的神经功能评分 NSS、BWT 在 28d 时较梗塞对照组有所提高（Plt;0.05） ，改善程度稍小于经颈动脉移植组，但无统计学意义（Pgt;0.05） 。静脉移植组普鲁士蓝染色的阳性细胞基本在梗塞边缘较密集分布，MRI 显示 MCAO 大鼠脑内梗塞
12、灶周围环形或片状 T2WI 和 FFET2WI 明显低信号；经颈动脉移植对照组的 MCAO 大鼠普鲁士蓝染色可见梗塞侧弥散分布较多的阳性细胞，MRI 显示梗塞侧弥散低信号；与两组的免疫组化结果相吻合。结论：经尾静脉注射移植BMSCs 可改善 MCAO 大鼠的神经功能损害。Feridex 可以用于 BMSCs 移植的活体示踪。 结论： 1.体外培养骨髓基质细胞，增殖迅速，易筛选，传 3 代的细胞可作为脑血管疾病干细胞移植治疗理想的细胞来源。 2.线栓法制作MCAO 大鼠模型具有较稳定的缺血范围和较高的成功率，是脑梗塞研究较为稳定的动物模型。 3.Feridex 可以在体外成功标记 BMSCs，M
13、RI 各脉冲序列显示信号佳，FFET2WI 对其磁效应尤为敏感，信号强度与标记细胞数量呈明显的负相关。 4.移植的 BMSCs 能在脑梗塞大鼠脑内存活、趋向梗塞区，并能向神经细胞方向分化。 5.经尾静脉注射移植 BMSCs 可改善 MCAO 大鼠的神经功能缺损。 6.利用 1.5T MRI 可对经尾静脉移植的 Feridex 标记 BMSCs 进行稳定的活体追踪，Feridex 可作为观察 BMSCs 移植的可靠活体示踪剂。正文内容脑血管病已经成为人类致死致残最主要的原因之一，其发病率有逐年上升的趋势，其中以缺血性脑卒中最常见。神经干细胞的发现和分离成功打破了神经组织损伤不能再生的传统观念。目
14、前国内外相关研究大多将骨髓基质细胞直接移植到脑缺血区域，获得了令人振奋的治疗效果。通过立体定向或者开颅直接注射入损伤部位或者直接注射入脑室脑池，能将 BMSCs 直接送达受损部位，提高移植物抵达靶点的数量。因开创性手术对脑组织产生一定的损伤；不便多次多靶点注射；同时也存在无菌性蛛网膜炎和蛛网膜下腔粘连的危险。本研究选择经尾静脉注入骨髓基质细胞，简便、安全、快捷，一次可以输入较多数量的 BMSCs，进入脑内的 BMSCs 分布在缺血坏死灶周边区。本研究主要解决的问题是 BMSCs 经尾静脉注射移植后，如何在活体内检测移植细胞的定向归巢和细胞增殖。本研究方法是使用活体示踪剂超顺磁性氧化铁颗粒 Fe
15、ridex（商品名：菲立磁）在磁共振下体内外观察被标记的 BMSCs，监测 BMSCs 在脑内存活、增殖和向神经分化，分析对 MCAO 大鼠的神经功能评分改变的影响，评价经静脉注射移植 BMSCs 以及 Feridex 标记 BMSCs 的可行性。 第一部分 大鼠骨髓基质细胞的体外培养实验研究 目的：探索大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的体外培养方法。 方法：体外分离 6090 g SD（SpragueDawley）大鼠骨髓，贴壁法扩增培养大鼠 BMSCs，相差显微镜观察原代及不同传代细胞的生长特性及形态变化，并进行细胞表型鉴定和巢蛋白（nes
16、tin） 、神经元特异性核蛋白（Neuronal specific neucleoprotein，NeuN） 、胶质原纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）免疫细胞化学鉴定。 结果：培养的 BMSCs 传代 12 小时后贴壁率高达 95%，在第 3 代纯度可达到 92%。大鼠 BMSCs 经分离纯化并传代后能表达 nestin、NeuN、GFAP 等特异性标记物，传到第 3 代后镜下 nestin 阳性细胞率为 80.1%，GFAP 阳性细胞率为 28.7%，NeuN 阳性细胞率为 14.5%。 结论：传 3 代的细胞可作为理想细胞移植治疗的细
17、胞来源。 第二部分 Feridex 标记骨髓基质细胞体外实验研究 目的：应用超顺磁性氧化铁 Feridex 和阳离子转染试剂多聚赖氨酸（PLL）复合物 FeridexPLL 体外标记大鼠骨髓基质细胞（BMSCs） ，初步评价磁共振成像示踪 Feridex 标记 BMSCs 的可行性。 方法：体外分离 6090 g SD 大鼠骨髓，贴壁法扩增培养大鼠 BMSCs，并用 FeridexPLL 体外标记，用普鲁士蓝染色和台盼兰排斥试验鉴定细胞内铁以及标记细胞的活性；利用 MRI 不同序列快速自旋回波（TSE）脉冲序列 TSET1WI、TSET2WI、FFET2WI 分别对 FeridexPLL 标记
18、后 BMSCs 和未标记 BMSCs 按1105、5105、6105 不同细胞数量进行成像，分析其信号强度值和强度变化率（ASI）与不同序列、标记情况和标记细胞数量的关系。 结果：FeridexPLL 对 BMSCs 体外标记率近 100%，对细胞形态和活性无明显影响。未标记细胞在 TSET1WI、TSET2WI 与 FFET2WI 之间的信号强度无统计学差异。细胞标记与不标记间的 MRI 各序列信号强度之间差异显著（Plt;0.001） ，前者随着细胞数量的增加而增强。各序列信号强度测量值在细胞是否标记与标记细胞数量之间交互效应较大。3 个序列中以 FFET2WI 的信号强度变化率（ASI）
19、最大，对磁标记细胞的显示最为敏感。在各成像序列上不同标记数量的细胞与未标记细胞之间的信号强度显示明显的统计学差异（Plt;0.001） 。各序列 ASI 在细胞是否标记与标记细胞数量之间有较小的交互效应。 结论：MRI 成像显示标记后 1105 个细胞即可引起明显的信号改变，FFET2WI 序列最为敏感，信号强度与细胞数量明显相关，非常适用于 BMSCs 体内外的示踪研究。FeridexPLL 是 BMSCs 比较理想的示踪剂，标记率高。 第三部分 线栓法制备 MCAO 大鼠模型 目的：用线栓法制作 SD 大鼠大脑中动脉梗塞（MCAO）模型，方法简单、易行、梗塞范围恒定、模型稳定。 方法：选用
20、健康、成年雄性清洁级 SD 大鼠 100 只，用线栓法堵塞大脑中动脉 2h，再灌注后 3d 内ZeaLonga 评分 23 分为成功模型。模型制造后 3d、7d 通过神经功能缺损严重程度评分（modified Neurological Severity Scores，NSS）和横木行走实验（Beam walking Test，BWT）评分观察其行为学改变，同时行 MRI 检查了解各序列梗塞病灶变化情况，再灌注后 7d 断头取脑，进行 TTC 染色及 HE 染色观察梗塞情况。 结果：技术未成熟时模型制备再灌注 24 小时内模型成功率为52%，3 日内模型成功率为 35%。后期模型制备的 28 只
21、老鼠 3 日内成功率 75%，死亡率和失败率均低。35 只成功大鼠模型的行为学评分：缺血再灌注后 3 天NSS7.632.613 分，7 天 NSS6.972.760 分，二者的有显著的统计学差异（P=0.006） ；缺血再灌注后 3 天 BWT 评分 5.231.864 分，7 天BWT5.032.062 分，二者无统计学差异（P=0.393） 。成功模型 MRI 扫描可见大鼠脑组织水肿明显，T2WI 示显著高信号，一周时水肿达高峰期；动态观察水肿程度随时间呈不同程度缓解；T2WI 信号递减，以梗塞周边区明显。TTC 染色见梗塞病灶范围基本恒定。 结论：技术成熟后，线栓法可制备稳定的 MCA
22、O 大鼠模型，能作为脑梗塞实验研究的模型。 第四部分 Feridex 标记 BMSCs 经尾静脉注射移植治疗 MCAO 大鼠及 MRI 示踪 目的：评估核磁共振示踪观察Feridex 标记移植后 BMSCs 存活、定向归巢能力和分化的效果。 方法：选用健康、成年雄性清洁级 SD 大鼠 100 只，随机分成经尾静脉注射移植治疗组（SPIOBrdUBMSCs 移植组，细胞数 3106，20 只） 、梗塞对照组（梗塞后SPIOPLL 单独注射，20 只） 、假手术移植组（SPIOBrdUBMSCs 移植，细胞数 3106，20 只） 、空白对照组（正常大鼠经尾静脉注射等容量 PBS，20 只） 、经
23、颈动脉注射移植治疗组（SPIOBrdUBMSCs 移植组，细胞数 2106，20 只）。缺血再灌注后 7d 经静脉或者动脉注射，按注射后处死时间3d、7d、14d、28d 分成亚组，每亚组均为 5 只大鼠。经尾静脉或者颈动脉注射移植 FeridexPLL 和 5溴脱氧尿核苷（5bromodeoxyuridine，BrdU）双标记的 BMSCs 或者经尾静脉注射 FeridexPLL、PBS，在各时相点分别进行大鼠行为学评分、MRI 各序列信号观察、取脑组织石蜡切片后进行普鲁士蓝染色及免疫组化染色、免疫双标共聚焦观测。 结果：经尾静脉细胞移植后 MCAO 大鼠的神经功能评分 NSS、BWT 在
24、28d 时较梗塞对照组有所提高（Plt;0特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?o 嫅#4K 錶 c#x 刔 彟 2Z 皙笜?D 剧珞 H 鏋 Kx 時 k,褝仆? 稀?i 攸闥-) 荮vJ 釔絓|?殢 D 蘰厣?籶(柶胊?07 姻Rl 遜 ee 醳 B?苒?甊袝 t 弟l?%G
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