1、利用不同分子标记分析烟草种质资源多态性 冯吉 程玲 孙光伟 陈振国 蔡长春 湖北省烟草科学研究院 摘 要： 目的研究烟草种质资源的遗传多样性及亲缘关系。方法利用 SSR、EST-SSR和 In Del 这 3 种分子标记对 53 份不同类型的烟草材料进行区别与鉴定。结果53 份烟草材料可分为 2 大类群, 2 个亚类;与 EST-SSR 和 SSR 分子标记相比, In Del 分子标记以其扩增谱带少、特异性强, 易于识别和统计, 更适合用于烟草种质资源遗传多样性分析与研究。结论该研究能够较好地揭示烟草栽培品种类型间的遗传多样性与亲缘关系, 可为烟草种质鉴定和遗传连锁图谱构建提供科学依据。关键
2、词： 烟草; 分子标记; 遗传多样性; 作者简介：冯吉 (1981) , 男, 湖北武汉人, 农艺师, 博士, 从事分子生物学、生物信息学研究。作者简介：蔡长春, 副研究员, 博士, 从事分子生物学研究。收稿日期：2017-08-11基金：中国烟草总公司湖北省公司重点项目 (027Y2016-002) Analysis of Genetic Diversity in Tobacco Germplasms ( Nicotiana tabacum L. ) Using Different Molecular MarkersFENG Ji CHENG Ling SUN Guang-wei CAI C
3、hang-chun Tobacco Research Institute of Hubei Province; Abstract： ObjectiveTo research genetic diversity and relationship in tobacco germplasms.Method53 tobacco materials were distinguished and identified by SSR, EST-SSR and In Del. Result53 tobacco materials could be classified into two groups and
4、two subgroups. Compared with the EST-SSR and SSR molecular marker, it was less amplification band, strong specificity, easy identification and statistics for In Del marker. Therefore, In Del molecular marker was more suitable for genetic diversity analysis and research of tobacco germplasm. Conclusi
5、onThe study is useful in revealing the genetic diversity and relationships among tobacco materials, and providing a scientific basis for the germplasm identification and genetic linkage mapping.Keyword： Tobacco; Molecular markers; Genetic diversity; Received： 2017-08-11烤烟是我国主要的经济作物之一, 其种植面积较大, 是卷烟工业
6、重要的基础原料1。但是用于烟草品系选育的材料遗传背景狭窄, 且育种周期长和工作效率低制约着传统育种工作的进度, 造成我国目前烟草育种创新能力较差2。因此, 拓宽烟草栽培品种遗传背景和优化烟草育种选择程序是今后高产、优质、多抗烟草新品种育种工作的关键。分子生物学的发展及分子标记技术的建立为烟草育种工作提供了可量化、不受环境影响的标准方法, 越来越多地被应用到烟草种质鉴定工作中。SSR、TRAP、AFLP 等分子标记具有结果可靠、重复性好、多态性丰富、操作简单等特点, 已被应用于烟草种质鉴定中2-7。该研究利用已公布的烟草 SSR 标记, EST-SSR 标记以及自主开发的 In Del 标记对
7、53 份烟草种质资源的亲缘关系进行分析, 为烟草种质资源鉴定和遗传育种研究提供新的分子标记, 并为拓宽烟草育种遗传基础以及烟草种质资源的研究和利用奠定理论基础。1 材料与方法1.1 不同分子标记1.1.1 EST-SSR 引物对序列。选取多态性较好的 16 对引物对8, 引物对序列见表 1。1.1.2 SSR 引物对序列。选取多态性较好的 20 对引物对9, 引物对序列见表 2。表 1 16 对烟草 EST-SSR 引物信息 Table 1 Information of 16 pairs of tobacco EST-SSR primer 下载原表 1.1.3 In Del 引物对序列。随机选
8、择并开发出 45 对引物对, 引物对序列见表 3。1.2 材料表 2 20 对烟草 SSR 引物信息 Table 2 Information of 20 pairs of tobacco SSR primer 下载原表 表 3 45 对烟草 In Del 引物信息 Table 3 Information of 45 pairs of tobacco In Del primer 下载原表 试验材料以烤烟为主, 并适当选取其他材料, 共计 53 份。其中烤烟 33 份, 白肋烟 15 份, 晒烟 3 份, 香料烟 2 份 (表 4) 。选取新鲜幼嫩的叶片 35 片, 每份材料取样 3 株, 每株材
9、料单独保存在超低温冰箱中备用。表 4 53 份烟草名称 Table 4 53 tobacco names 下载原表 1.3 方法1.3.1 CTAB 小样法提取 DNA。选取 53 份烟草种质资源材料的鲜嫩叶片, DNA 提取方法参考 CTAB 方法2-7。1.3.2 PCR 扩增。PCR 反应体系含模板 DNA 2L, Bio Teke 的 2power Taq PCR Master Mix (PR1701) 5L, 正向和反向引物 (50 ng/L) 各 1.5L, 总体积 10L。PCR反应程序为 945 min;9430 s, 退火温度 (5062) 30 s, 721 min, 35
10、个循环;7210 min;4保存。在 TP600 梯度 PCR 仪 (Ta KaRa, 日本) 上进行PCR 反应。1.3.3 多态性引物的筛选。对 53 份烟草材料初步筛选 InDel, EST-SSR 和 SSR 引物对;选择电泳条带清晰且稳定、多态性丰富的引物对进行 DNA 扩增。1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。PCR 扩增产物均用聚丙烯酰胺凝胶 (6%) 进行电泳分离, 电泳所用仪器为SequiGen sequencing cell (Bio-Rad, USA) , 缓冲液为 0.5TBE。电泳时先用恒定功率 100 W 预电泳 30 min 左右 (玻璃板面温度约为 50) ,
11、上样后, 用恒定功率 80 W 电泳 1.01.5 h, 快速显影方法进行电泳后的染色与显影。1.3.5 数据处理。统计数据时, In Del, EST-SSR 和 SSR 多态性定义为在扩增产物凝胶电泳带型的某一相同迁移位置上, 品种某一条带的有或无, 每 1 个多态性条带记作 1 个等位基因 (假定相同迁移率的条带均来自同一位点上的同一等位基因) 。将电泳图谱上清晰出现的条带记为“1”, 同一位置无带记为“0”, 不清楚难以判断的带记为“.”或“-”, 获得“0”和“1”组成的数字矩阵。1.3.6 遗传多样性分析和聚类树的绘制。将 53 个烟草种质资源材料的分子标记数据按要求制成表格, 并
12、采用聚类软件NTSYS 计算遗传相似性系数, 然后根据遗传相似性系数进行类平均法 (UPGMA, unweighted pair group method arithmetic averages) 聚类, 形成数字矩阵, 绘出聚类树, 形成种质资源的分类。2 结果与分析2.1 In Del 分子标记的开发利用 B37 (红) 和 B37 (白) 的重测序数据9, 与已发表的 K326 和 TN90 数据10-11进行生物信息分析, 预测得到 353 349 个 In Del 位点。通过 In Del 标记建立矩阵, 利用矩阵分析样本之间的多态性, 参考前人研究筛选参数12:插入/缺失碱基数为
13、515 bp、插入/缺失变异率 (变异率=同类插入/缺失占重测序总样品量的百分比) 为 30%70%的 In Del 位点, 最终随机选择并设计出具有代表性 In Del 引物 45 对。2.2 烟草 In Del, EST-SSR 和 SSR 的多态性检测2.2.1 In Del 分子标记的多态性检测。用 45 对 In Del 引物对 53 份烟草种质资源材料进行多态性检测, 其中只有 20对 In Del 引物多态性检测能力较强, 多态性比例为 44.44%。利用这 20 对 In Del 引物在 53 份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的 40 个多态性位点, 每对引物能得到 2 条多
14、态性条带。部分 In Del 引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图 1。2.2.2 EST-SSR 分子标记的多态性检测。用 16 对 EST-SSR 引物对 53 份烟草种质资源材料进行多态性检测, 其中只有 9对 EST-SSR 引物多态性检测能力较强, 多态性比例为 56.25%。利用这 9 对 EST-SSR 引物在 53 份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的 33 个多态性位点, 每对引物能得到 26 条多态性条带, 平均为 4 条。部分 EST-SSR 引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图 2。图 1 In Del 引物 (To In031) 对烟草材料的扩增结果 Fig.1 The am
15、plification results of In Del primer (To In031) on tobacco materials 下载原图图 2 EST-SSR 引物 (TM11157) 对烟草材料的扩增结果 Fig.2 The amplification results of EST-SSR primer (TM11157) on tobacco materials 下载原图2.2.3 SSR 分子标记的多态性检测。用 20 对 SSR 引物对 53 份烟草种质资源材料进行多态性检测, 其中只有 15 对SSR 引物多态性检测能力较强, 多态性比例为 75.00%。利用这 15 对
16、SSR 引物在53 份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的 70 个多态性位点, 每对引物能得到 29 条多态性条带, 平均为 5 条。部分 SSR 引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图 3。图 3 SSR 引物 (PT20289) 对烟草材料的扩增结果 Fig.3 The amplification results of SSR primer (PT20289) on tobacco materials 下载原图2.3 烟草遗传多样性分析和聚类树的绘制利用 NTSYS 软件计算种质资源的遗传相似性系数。53 份材料的遗传相似性系数为 0.370.97, 平均为 0.75。说明 53 份烟草种质资源
17、的遗传多样性较低, 遗传背景变异较少。基于遗传相似性系数, 进一步对 53 份材料进行聚类分析, 绘制了 UPGMA 聚类图 (图 4) 。在遗传相似性系数为 0.48 时, 53 份材料被分为 2 类群。其中第一类群为所有晾晒烟材料 (包含白肋烟、晒烟和香料烟) 和部分烤烟材料, 第二类群为烤烟材料。第一类群在遗传相似性系数为 0.53 处, 又可分为 2 亚类。第 1 亚类为大部分的白肋烟材料和部分烤烟材料, 第 2 亚类为全部晒烟、香料烟、部分烤烟以及部分白肋烟材料。图 4 分子标记技术绘制的烟草种质资源 UPGMA 聚类图 Fig.4 UPGMA cluster diagram of
18、tobacco germplasm resources drawn by molecular markers 下载原图以上结果可以说明:分子标记技术在烟草资源遗传亲缘关系分析中的高效性;晾晒烟种质资源材料与烤烟种质资源材料遗传亲缘关系相对较远, 而不同晾晒烟种质资源材料之间 (包含白肋烟、晒烟、香料烟) 的遗传亲缘关系很近。3 结论与讨论随着分子生物学的发展及分子标记技术的建立, 越来越多的分子标记被应用到烟草种质鉴定、遗传图谱的构建、抗病性研究等工作中2-7,9。该研究中SSR、EST-SSR 和 In Del 这 3 种分子标记多态性丰富, 稳定性强, 试验条件较易掌握, 都是很好的烟草遗
19、传多样性分析的分子标记方法。但是与 EST-SSR 和SSR 分子标记相比, In Del 分子标记以其扩增谱带少、特异性强, 易于识别和统计, 因而更适合用于烟草种质资源遗传多样性分析与研究。遗传多样性对物种的生存和发展起着决定性的作用, 遗传多样性高, 对环境变化的适应能力强, 容易扩展其分布范围并孕育成新的品种, 因此对遗传多样性的研究, 可以探讨物种之间的亲缘关系, 同时还有助于充分发现和利用各种基因资源, 挖掘重要经济性状的变异并加以科学利用和开发。烟草传入我国已有400 多年时间, 虽然经过 400 多年的人工驯化和培养以及不断地从国外引进已经形成的品种资源, 但是近年烟草育种中广
20、泛使用的主体亲本只有少数几种, 导致我国育成烟草品种遗传基础日益狭窄13-14, 该研究结果也从分子水平上印证了我国烟草育种资源的匮乏。该研究还发现相同栽培类型的烟草明显地聚为一类, 说明烟草经过各自的生态环境和人为利用目的不同的长期选择而逐渐形成了不同的栽培类型, 类型间的差别更多的是因特定生态条件下次生代谢的不同而形成。同时, 还发现个别烟草材料偏离原有类型, 与其他类型聚为一类, 原因一可能是与其血缘关系有关, 二可能是与分子标记的偏好有关。参考文献1国家烟草专卖局.中国烟草年鉴:2011-2012M.北京:中国科学技术出版社, 2012. 2祁建民, 梁景霞, 陈美霞, 等.应用 IS
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