1、基于高光谱图像和激光共聚焦显微镜技术快速测定猪肉嫩度 朱瑶迪 申婷婷 赵改名 邹小波 李苗云 石吉勇 河南农业大学食品科学技术学院 江苏大学食品与生物工程学院 摘 要： 以背最长肌和腰大肌为对象, 利用高光谱图像 (HSI) 和激光共聚焦显微镜技术 (CLSM) 研究猪肉嫩度。利用 CLSM 结合荧光染色观察纤维密度和直径等组织学特性参数, 判断不同部位猪肉嫩度。通过主成分分析 (PCA) 对其图像信息进行PCA, 然后对光谱信息进行预处理。依据图像信息优选出 3 幅特征图像, 提取对比度、相关性、角二阶矩和一致性等 4 个基于灰度共生矩阵的纹理特征变量, 利用 K-最邻近法 (KNN) 建立
2、预测模型, 为验证 HSI 的判别度。结果表明:KNN模型校正集和预测集的识别率分别为 91.24%, 83.57%, 识别出腰大肌较背最长肌嫩。腰大肌的纤维直径和密度分别比背最长肌细且密, 其观察结果与 HSI 的判别结果相一致。利用 HSI 快速预测猪肉嫩度具有可行性。关键词： 食品检测; 猪肉嫩度; 高光谱图像技术; 纹理特征; 激光共聚焦显微镜; 作者简介：朱瑶迪, 女, 1987 年出生, 博士生作者简介：邹小波 E-mail:zou_收稿日期：2016-11-18基金：高新技术发展计划国家 863 项目 (2011AA100807) Rapid Detection of Pork
3、Tenderness Based on Hyperspectral Imaging and Confocal Laser Scanning MicroscopyZhu Yaodi Shen Tingting Zhao Gaiming Zou Xiaobo Li Miaoyun Shi Jiyong School of Food Science and Technology, Henan Agricultural University; School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University; Abstract： The pso
4、as major and the longest muscle of pork were as example in this study. The confocal laser scanning microscopy (CLSM) , which is an improvement over the traditional light microscopy in that it has the capability to scan product at different depths, reduce artifacts, and produce higher resolution imag
5、es, was used to research the muscle fibers diameter and density to further judge the reliability of the hyperspectral results. A hyperspectral imaging system, which consists of both a digital camera and a spectrograph, can acquire images with both high spatial and spectral resolution contents. There
6、fore, HSI may capture both spatial and biochemical information simultaneously so that the texture characteristic of predicting the pork samples tenderness could be much greater. First, hyperspectral images of 80 pork samples were captured by HSI system. Dimension reduction was implemented on hypersp
7、ectral data by principal component analysis is (PCA) to select 3 characteristic images. Next, 4 characteristic variables were extracted by texture analysis based on gray level co-occurrence matrix (GLCM) , which is effective tool to calculate the texture characteristic of the samples. They are contr
8、ast, correlation, angular condmoment and homogeneity, respectively. Thus 12 characteristic variables in total for 3 characteristic images were extracted. PCA was conducted on 12 characteristic variables, and the sixth PCs variables were extracted as the input of the discrimination model. The detecti
9、on model of pork tenderness was constructed by K-Nearest Neighbor (KNN) , according to the reference results of pork tenderness by Warner-Bratzler method. Detection results of KNN model are 91.24% and 83.57% in calibration and prediction sets, respectively. In addition, the result is consistent with
10、 the result of HSI using CLSM. This work shows that it is feasible to detect pork tenderness by HSI technique. Results are encouraging and show the promising potential of hyperspectral technology for detecting pork tenderness.Keyword： food detection; pork tenderness; hyperspectral imaging; texture c
11、haracteristic; confocal laser scanning microscopy; Received： 2016-11-18肉的嫩度是指肉入口咀嚼组织状态时所感觉的印象1, 即评价肉制品食用物理特性的重要指标。我国是猪肉生产和消费的大国, 其嫩度是评价猪肉品质的重要标准, 生产中实现准确、快速的嫩度检测是非常有意义的2。目前, 检测猪肉嫩度的方法主要是人工感官评价和理化检测, 然而它们存在主观因素干扰, 误差较大, 处理过程繁琐, 测定时间长等3缺陷。快速检测猪肉嫩度的方法主要有近红外光谱技术 (NIR) 4-5、计算机视觉技术6和高光谱图像技术7-8等, 前两个都是基于单一
12、技术手段完成的, 仅能反映猪肉内部化学组成信息, 无法获取样本的外部特征信息;仅能检测样本的外部纹理特征信息。高光谱图像技术可利用光谱和图像信息同时获取样本的内部化学组分信息和外在的纹理特征信息, 目前该技术一般用来检测猪肉等级9-10、质量11及新鲜度12-14等方面, 而在检测猪肉嫩度, 尤其是联合肌肉组织学特性方面鲜有报道。激光共聚焦显微镜 (CLSM) 是近代发展起来的重要生物图像仪器之一, 主要用于具有荧光样品的测定。它是在荧光显微镜的基础上加装激光扫描装置, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 并利用计算机进行图像处理, 可清晰、直观地观察样品荧光图像15-16, 且其分辨率高, 荧光
13、定位准确, 不破坏样品的结构、形态, 对试验结果无干扰等特征。本研究使用异硫氰酸荧光素 (FITC) 和核酸荧光染料 4, 6-二脒基-2-苯基吲哚 (4, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 将猪肉蛋白和细胞核进行荧光染色, 观察不同猪肉肌纤维密度和直径等组织学特性的荧光图像, 分析不同部位猪肉嫩度的差异性。猪肉嫩度与肌肉剪切力、肌纤维密度及肌纤维直径等参数密切相关17-19, 是目前研究较多反映肌肉嫩度的指标。本文提出集光谱信息和图像信息于一体的高光谱图像技术, 尝试用 K-最邻近法 (K-the nearest neighbor method, KNN)
14、方法快速评判猪肉嫩度, 并用 CLSM 观察不同部位猪肉肌纤维的荧光图像, 验证高光谱图像技术快速预测不同部位猪肉嫩度的可行性。1 材料和方法1.1 材料猪肉, 当天屠宰, 取左胴体胸腰椎连接部背最长肌和腰大肌。将肉样本处理成5 cm5 cm2cm 肉块, 依据 NY/T 1180-2006 对测试样本的要求进行光谱采集 (高光谱相机, Im Spector, V10E, 芬兰) , 共采集到 80 个样本, 0.5 cm0.5 cm1cm 组织块, 置于 10%中性甲醛液 (V 样 V 液 =15) 固定, 4保存, 激光共聚焦显微镜 (Leica TCs P5, 德国) 。1.2 组织样品
15、处理将固定在中性甲醛溶液中的组织修整、洗涤, 用冷冻切片机切片。切片厚度30m, 每个样本 3 个平行样。在使用 CLSM 前, 先用 FITC 对切片进行染色。肌纤维直径测量:利用 CLSM 圈出视野中 5001 000 根的肌纤维, 计算每根肌纤维的面积, 并默认“圆”的面积。根据 S=r (r 为半径) 自动计算每根肌纤维的等效直径, 取其平均值。肌纤维密度的测量:测每个视野内的肌纤维根数, 以及这个视野内的面积, 换算成每 mm 的根数, 即肌纤维密度。取 810 个视野的平均值。1.3 猪肉剪切力的测定猪肉嫩度的测定主要依据我国农业行业标准 NY/T1180-2006肉嫩度的测定-剪
16、切力测定法来评定肉嫩度, 即利用 TA-X12i 型质构仪对猪肉样本的嫩度进行细致的研究。1.4 高光谱图像的采集和标定1.4.1 高光谱图像的采集高光谱图像数据采集系统如图 1 所示。为了防止基线漂移, 数据采集前将高光谱图像系统预热 30 min, 然后进行黑白板校正14。数据采集时, 将不同部位的猪肉样品放在电控平移台上, 设定相关参数, 其中传输带速度经反复试验确定为 1.25 mm/s, 以避免图像尺寸和空间分辨率失真, 并预先确定高光谱相机的曝光时间为 45 ms, 图像扫描行数为775 行/幅;每行扫描个数为 1 628, 得到的高光谱图像分辨率为 7751 628 像素;光谱范
17、围是 432963 nm, 采集到 618 个波长下的图像, 最终得到一个7751 628618 pixel 的高光谱图像数据块。高光谱图像的特点:既有各波长下的图像信息, 也有各像素点对应的光谱信息。图 1 基于图像光谱仪的高光谱图像采集系统示意图 Fig.1 Hyperspectral imaging system based on spectrometer 下载原图1.4.2 高光谱图像的标定高光谱图像数据采集完成后, 需要对所获得的高光谱图像进行黑白标定20。在与样品采集相同的条件下, 采集标准白色校正板得到全白的标定图像 W, 关闭相机快门采集得到全黑的标定图像 B。根据式 (1)
18、完成高光谱图像的标定, 使采集的绝对图像 Io变成相对图像 I:1.4.3 特征波长的提取与传统光谱或图像技术相比, 高光谱图像技术具有波段数多且连续、光谱范围窄, 数据量大等特点, 可同时提供空间信息和光谱信息, 使目标所获的信息量更完整21-23。然而, 高光谱数据量大, 波段间冗余性强的特点也会给后期的数据处理和建模造成一定的影响, 因此选择一些具有代表性的特征波长就变得非常重要。通过主成分分析来优选特征波长, 根据方差贡献率的大小提取前面几个主成分图像, 从中找到最能表征原始信息的主成分图像, 以及最能表征原始信息的主成分图像。每个主成分图像都是由原始数据中的各波长下的图像经过线性组合
19、而成的。通过比较线性组合中的权重系数, 局部最大权重系数所对应波长下的图像为特征图像。本研究优选出 80 个样本的前 3 幅主成分图像PC1、PC2 和 PC3 (累计贡献率大于 99%) 中各波长的平均权重系数绝对值, 共选取 3 个特征波长, 依次为 660.29, 695.72 和 730.43 nm。猪肉中大量肌原纤维蛋白和细胞骨架蛋白在这 3 个波长均有吸收。图 2 猪肉样本的前 3 个主成分图像 (a-c 为 PC1, PC2 和 PC3) 和 3 个特征波长处的图像 (d-f, 660.29, 695.72 and 730.43 nm) Fig.2 Characteristic
20、pictures selected by PCA. (a-c) First three principle component (PC1, PC2 PC3) score images; (d-f) three feature pictures at 660.29, 695.72 and 730.43 nm selected in PC1 image 下载原图1.4.4 纹理特征的提取不同部位猪肉纹理是有差异的24-25, 可以利用其纹理特征对猪肉嫩度进行快速识别1。本研究采用基于灰度共生矩阵法来提取猪肉图像的纹理特征, 即提取 3 个特征波长下的纹理特征作为特征变量。式中, i, j灰度值;p
21、 (i, j) 概率; i和 j变量。灰度共生矩阵是像素间距离和角度的矩阵函数26-27。本文利用 MATALB 中的graycomatrix 函数, 将距离参数值固定为 1, 方向依次取 0, 45, 90和135。依据上述公式 (2) (5) 分别提取对比度、相关性、角二阶矩和一致性等 4 个基于纹理特征变量, 对 3 幅图像 PC1, PC2 和 PC3 进行 4 个纹理特征的提取, 每个样品 12 个变量。1.5 数据分析采用统计用软件 SPASS (美国 BM 公司) 进行数据的统计分析。使用 MATLAB (美国 Mathworks 公司) 软件进行图像处理。2 结果与讨论2.1
22、共聚焦显微镜观察猪肉的微观结构猪肉中肌纤维密度与肌纤维直径有关, 在单位面积内直径越大密度越小。将猪肉肌纤维使用 FITC 染色, 经检测, 背最长肌的肌纤维直径在 88.2790.04m之间, 腰大肌直径在 79.1485.67m 之间, 背最长肌直径明显比腰大肌的大 (图 3a 和 4b) 。图 3c 和 3d 分别是背最长肌和腰大肌横切时的图片。使用 DAPI染色剂对细胞核酸进行染色, 可以明显看到背最长肌的直径大于腰大肌的, 并且背最长肌比腰大肌的肌纤维分布清晰, 而两者的肌纤维组成在微观有明显的差异。另外, 腰大肌的肌纤维密度为 (29512.84) 根/mm, 而背最长肌的纤维密度
23、为 (22110.65) 根/mm, 较腰大肌小, 明显反映腰大肌较嫩。图 3e 和 3f分别是图 3c 和 3d 的荧光图, 可明显看出猪肉细胞围绕在肌纤维的周围, 肌内结缔组织呈交叉状态分布。从背最长肌和腰大肌的微观图中可看出腰大肌肌纤维细, 所能承载的垂直剪切力小, 其肉质嫩。图 3 共聚焦显微镜下猪背最长肌和腰大肌的微观图像 Fig.3 The microscopic image of the longest back muscle and psoas major muscle under confocal laser scanning microscopy 下载原图注: (a) 背最
24、长肌经 FITC 染色后的微观图像; (b) 腰大肌经 FITC 染色后的微观图像; (c) 背最长肌经 DAPI 染色后横切面的微观图像; (d) 腰大肌经 DAPI染色后横切面的微观图像; (e) 背最长肌经 DAPI 染色后横切的荧光图像; (f) 腰大肌经 DAPI 染色后横切的荧光图像。2.2 高光谱模型猪肉有脂肪、蛋白等, 它们的分布直接影响猪肉的嫩度。利用 KNN 对得到的 57个光谱数据建模, 然后利用预测集的 23 个样本来验证模型的可靠性。每个样本12 个纹理特征变量, 它们之间存在一定的相关性。在建模之前有必要对它们进行主成分分析, 提取主成分因子。在使用 KNN 法建模
25、时, 需对 K 值进行优化。选取前 20 个主成分和 9 个 K 值同步对 KNN 模型进行优化。由图 4 可知, 主成分数为 9, 其主成分累计方差贡献率均超过 99%;在 K 值为 3 时, KNN 判别模型校正集和预测集的识别结果分别是 91.24%, 83.57%, 可识别出腰大肌较嫩, 与共聚焦显微镜观察结果一致, 表明利用高光谱图像技术快速判别猪肉嫩度是可行的。3 结论使用 CLSM 结合 FITC 和 DAPI 荧光染色剂观察猪肉的肌纤维直径和密度, 判断不同部位猪肉的嫩度。利用高光谱图像技术结合 K-最邻近法 (KNN) 快速判断不同部位猪肉嫩度, 模型的校正集和预测集识别率分
26、别是 91.24%, 83.57%。这与共聚焦显微镜观察结果相一致, 表明利用高光谱图像技术快速判别不同部位猪肉嫩度是可行的。本研究结果为快速识别不同部位猪肉嫩度提供技术手段。参考文献1陈璐, 金邦荃, 刘兴余, 等.猪骨骼肌组织学特性与猪肉嫩度关系的研究J.食品科学, 2009, 2 (1) :10-14. 2BARBIN DOUGLAS F, VALOUS NEKTARIOS A, SUN DW.Tenderness prediction in porcine longissimus dorsi muscles using instrumental measurements along w
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