1、分泌抗山羊 干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与鉴定 张洪杰 桑锋锋 刘阿华 李言言 王毅 陈德坤 西北农林科技大学动物医学院 摘 要： 为筛选分泌山羊 干扰素 (IFN-) 单克隆抗体的杂交瘤细胞, 以原核表达的山羊 rIFN- 蛋白免疫 Balb/c 小鼠, 取其脾脏细胞与 SP2/0 瘤细胞进行细胞融合, 以间接 ELISA 方法筛选分泌山羊 IFN- 单克隆抗体杂交瘤细胞, 采用山羊外周血淋巴细胞产生的 IFN- 包被酶标板对 IFN- 的特异性进行鉴定, 用试纸条对 IFN- 单克隆抗体类别和亚型进行鉴定。结果获得了 1 株能特异性识别山羊 IFN- 的杂交瘤细胞 3C, 3C 分泌
2、的单克隆抗体能够特异性识别天然结构的山羊 IFN-, 单克隆抗体类别为 IgG, 轻链为 型。关键词： 山羊; 干扰素; 杂交瘤细胞; 作者简介：张洪杰 (1990-) , 男, 河南驻马店人, 硕士研究生, 主要从事兽医病原学与免疫学研究。收稿日期：2017-04-10基金：基金项目:陕北白绒山羊主要疫病防控关键技术研究与示范 (2015KTTSNY04-04) Preparation and Identification of Hybridoma Cell Lines Secreting Antibodies against Goat IFN-gammaZHANG Hong-jie SAN
3、G Feng-feng LIU A-Hua LI Yan-yan WANG Yi CHEN De-kun College of Veterinary Medicine, Northwest A Abstract： In order to prepare hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against goat IFN-, Balb/c mice were immunized with purified prokaryotic recombiant goat IFN- (rIFN-) and the splenocytes were
4、 isolated and fused with SP2/0 myeloma to generate hybridoma cells.Then the supernatant was collected to identify the monoclonal antibodies recognizing goat IFN-specifically.In the present study, an I-ELISA method was established to detect antibodies against goat IFN-when the antigen was coated with
5、 goat lymphocytes.Then the classes and types of monoclonal antibodies against goat IFN-were characterized by quick test strip.The results suggested that a strain of hybridoma cell named 3 Cwhich showed high specificity was prepared successfully, and the monoclonal antibody was identified as IgG clas
6、s and kappa type.Keyword： goat; IFN-; hybridoma cell; Received： 2017-04-10 干扰素 (IFN-) 主要由活化 T 细胞和 NK 细胞产生, 参与细胞免疫, 具有抗病毒感染、抗肿瘤等生物学活性, IFN- 能够增强受体介导的吞噬功能, 加强巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤活性。一方面, IFN- 可诱导巨噬细胞、T 细胞、B 细胞等细胞 MHC类分子表达, 提升抗原呈递能力;另一方面, 能活化巨噬细胞促进杀伤胞内寄生病原。活化的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的水平也明显提高。而且, 在局部炎症反应中, IL-1、IL-17 等细胞因子量的
7、变化会引起IFN- 表达量的差异1。因此, 炎症部位 IFN- 含量的变化可作为评估机体免疫功能的重要指标, 为疾病的诊断治疗和相关机理研究提供新的思路。目前市面上尚未见到山羊 IFN- 单克隆抗体的相关产品, 这不利于山羊 IFN- 的相关研究。本试验通过 ELISA 方法筛选分泌山羊 IFN- 单克隆抗体的杂交瘤细胞, 并对抗体的特异性、亚型等进行鉴定, 获得了山羊 IFN- 单克隆抗体, 为山羊 IFN- 检测奠定了技术基础2。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 材料雌性 Balb/c 小鼠, 6 周龄, 购自空军大学实验动物中心;纯化的山羊 rIFN-蛋白、纯化山羊 rIL-1 蛋白
8、、纯化山羊 rIL-17 蛋白、纯化空载体融合标签蛋白、SP2/0 细胞, 由西北农林科技大学动物医学院兽医免疫学实验室 (以下简称本实验室) 保存。1.1.2 主要试剂与仪器完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂为 Sigma 公司产品;羊抗鼠 IgG 酶标抗体为北京博奥森公司产品;TMB 显色液为天根生化科技有限公司产品;小鼠抗体亚型鉴定试剂盒为 Roch 公司产品;Ni-NTA 琼脂糖凝胶镍柱为上海 TransGen 公司产品;异丙基-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 为购自 Sigma 公司产品;酶标仪为 Bio-Rad 公司产品;酶标板为 Castor 公司产品;其他试剂为进口或国产分析纯。1.
9、2 方法1.2.1 免疫原制备将纯化的山羊 rIFN- 蛋白冻干粉3溶于蒸馏水, 测定浓度, 配制成 1 mg/mL。取完全弗氏佐剂 1 mL 与等量山羊 rIFN- 蛋白溶液混匀, 用注射器吸入三通管置于冰上来回推打乳化, 约 1h 后, 取一小滴滴于平静水面上, 乳化物20min 内不散开, 此作为免疫原备用;按照同样方法取 1mL 山羊 rIFN- 蛋白溶液与等量不完全弗氏佐剂混匀乳化备用。以上抗原的制备均现用现配。1.2.2 小鼠免疫取上述制备好的抗原, 按照 200L/只, 对 6 周龄雌性 Balb/c 小鼠进行首免。首免后第 21 天进行二免, 二免用的抗原为不完全弗氏佐剂与山羊
10、 rIFN- 乳化所制, 免疫剂量和途径同首免。二免后第 15 天进行第 3 次免疫, 三免抗原、剂量和途径同二免一样。三免后第 9 天测定免疫小鼠血清抗体效价。免疫次数以小鼠血清抗体效价达到要求为目标。1.2.3 山羊 IFN- 抗体的 ELISA 检测取上述配制好的 1mg/mL 山羊 rIFN- 蛋白溶液, 调整其蛋白浓度为 10g/mL, 100L/孔加入 96 孔 ELISA 酶标板内, 封口后 4放置 14h;弃去酶标板内液体, 加入 PBST 溶液洗涤, 重复洗涤 3 遍后, 加入 10mL/L 鸡血清的 PBST 溶液100L/孔封闭, 置于 37生化培养箱 1h;弃去孔内液体
11、, 按如上方法洗涤 3 遍, 加入本试验制备的稀释 1 000 倍的抗山羊 IFN- 单克隆抗体、稀释 1 000 倍的IFN- 阳性小鼠血清 (免疫鼠剪尾采血) 、稀释 1 000 倍的阴性血清 (未免疫鼠剪尾采血) , 100L/孔, 每个样品做 3 个重复, 封口后置于 37生化培养箱 1h;弃去板内溶液, 按如上步骤洗涤 3 遍, 用排枪吸取配制的羊抗鼠酶标二抗 (二抗PBST=15 000) 溶液 100L/孔加入板内, 封口后置于 37培养温箱 1h;弃去板内溶液, 按如上方法用 PBST 溶液清洗 5 遍, 避光加入 TMB 溶液100L/孔, 于 37生化培养箱 20min;加
12、入 2mol/L 稀硫酸 100L/孔, 立即置于酶标仪上读数。1.2.4 脾细胞与 SP2/0 细胞融合于细胞融合前 1 周复苏 SP2/0 细胞, 扩大培养备用;融合前 1d, 制备饲养层细胞, 具体操作为将健康未免疫小鼠眼球摘除取血并分离血清, 作为阴性血清, 处死小鼠无菌处理后, 注射 RPMI1640 基础培养基到小鼠腹腔, 轻柔柔压后收集, 重复 3 次, 将收集的腹腔液 1 000r/min 离心 10min, 用 HAT 选择培养基重悬后, 加入 96 孔细胞培养板, 37、体积分数为 5%CO2条件下培养备用;融合当天取免疫小鼠按上述方法取其血清后无菌处理, 然后剖解小鼠取其
13、脾脏去除筋膜后置于 200 目筛网上研磨分离脾细胞, ;取培养至对数生长期的 SP2/0 细胞, 调整细胞浓度使脾细胞数量比 SP2/0 细胞数量在 10 (12) 10 范围, 按照融合剂 PEG1500 的操作说明来进行细胞融合, 最后将融合细胞加入到上述含有饲养层细胞的 96 孔培养板内, 37、体积分数为 5%CO2条件下培养8。1.2.5 分泌抗山羊 IFN- 单克隆抗体的杂交瘤细胞筛选每天观察培养板内的细胞, 当观察到大部分孔内有细胞团时, 吸取孔内培养基, 按照 1.2.3 方法检测, 保留阳性孔, 按照有限稀释法进行至少 3 次亚克隆, 并按 1.2.3 方法检测, 最终获得目
14、的杂交瘤细胞。1.2.6 抗山羊 IFN- 单克隆抗体特异性测定以本实验室保存的纯化山羊 rIFN- 蛋白、纯化山羊 rIL-1 蛋白、纯化山羊rIL-17 蛋白、纯化空载体融合标签蛋白和参照文献3制备的山羊外周血淋巴细胞培养上清为包被抗原, 以筛选获得的杂交瘤细胞分泌的抗体为一抗进行ELISA 检测, 检测获得的单克隆抗体与这几种抗原的反应性。1.2.7 抗山羊 IFN- 单克隆抗体效价测定将上述筛选所得杂交瘤细胞计数, 调整细胞浓度为 10 个/mL, 注射 500L 到提前 1 周用液体石蜡预处理的 Balb/c 小鼠腹腔内, 待小鼠腹部膨大后, 抽取腹水离心收集上清, 分装后置-20保
15、存备用;将腹水分别稀释 10、10、10、10、10倍, 按 1.2.3ELISA 检测, 确定腹水中抗体的效价。1.2.8 抗山羊 IFN- 单克隆抗体亚型鉴定及杂交瘤细胞染色体组型分析本试验采用 Roch 公司 Iso Strip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (抗体亚型检测试剂盒) 测定单克隆抗体类别和亚型, 操作步骤为先将腹水抗体稀释 210 倍, 使其浓度在 0.1g/mL1g/mL 之间, 吸取 150L 加入显色管内;在 1525下作用 30s, 轻轻晃动, 使蓝色粉末完全混匀;取一条试纸条将黑色端插入显色管底部, 作用 3 mi
16、n 左右观察结果。分泌抗山羊 IFN- 单克隆抗体的杂交瘤细胞染色体组型分析结果由西安交通大学第一附属医院提供。2 结果2.1 免疫小鼠血清抗体效价测定结果小鼠第 4 次免疫后第 9 天, 尾部采血分离血清, 进行 ELISA 检测, 检测结果表明, 其抗体效价达到 110 (表 1) 。表 1 第 4 次免疫后小鼠血清效价 Table1 Antibody titer of mouse serum after the fourth immunization 下载原表 2.2 脾细胞与 SP2/0 细胞融合结果对融合后细胞进行观察、检测后, 其融合率达到了 70%, 初次检测阳性率为 3% (图
17、 1) 。2.3 抗山羊 IFN- 单克隆抗体特异性鉴定结果筛选结果获得了 1 株阳性杂交瘤细胞, 命名为 3C。该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体不识别 rIL-1、rIL-17、空载标签蛋白等, 只识别山羊 rIFN-;其分泌的单克隆抗体与含有 IFN- 的山羊外周血淋巴细胞培养上清液发生反应, 即本株单克隆抗体不仅能识别原核表达山羊 rIFN-, 还能识别天然山羊 IFN- (表 2) 。2.4 单克隆抗体效价检测结果如表 3 所示, 使用间接 ELISA 方法测定, 将腹水稀释为 110 后, 其 OD450为0.161, 杂交瘤细胞上清液稀释为 110, 其 OD450为 0.134, P
18、/N 均大于 2/1, 即腹水抗体效价为 110, 杂交瘤细胞上清效价为 110。2.5 抗山羊 IFN- 单克隆抗体亚型鉴定和杂交瘤细胞染色体组型分析结果结果显示 (图 2 和图 3) , 单克隆抗体 3C 类别为 IgG1, 轻链类型为 型;杂交瘤细胞染色体数目为 SP2/0 细胞染色体数目与正常小鼠脾细胞的染色体数目之和, 符合融合细胞的染色体数目规律8。图 1 融合第 7d 杂交瘤细胞 Fig.1 Fused hybridoma cells in 7day 下载原图表 2 抗山羊 IFN- 单克隆抗体特异性鉴定结果 Table 2 The test of specific identi
19、fication of anti-goat IFN-antibodies 下载原表 表 3 抗体效价检测结果 Table 3 The test results of antibody titer 下载原表 3 讨论本研究采用间接 ELISA 方法筛选到 1 株分泌抗山羊 IFN- 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 对其分泌的单克隆抗体特异性、抗体类别鉴定表明, 该单克隆抗体能特异性识别山羊 IFN-, 抗体类别为 IgG1。同时本研究分离并培养了山羊外周血淋巴细胞, 用 con-A 刺激淋巴细胞产生天然山羊 IFN-, 收集后作为包被抗原, 检测结果表明, 本试验所得的单克隆抗体能特异性识别天然山羊
20、 IFN- 蛋白, 弥补了山羊 IFN- 单克隆抗体的空白。后续试验会针对抗体特性来决定其具体应用, 如胶体金试纸条的相关研究和流式细胞标记用抗体9。免疫小鼠过程中所用抗原为山羊 IFN- 原核表达蛋白, 原核表达蛋白具有生产周期短、易于纯化、表达量高等优点, 但其活性及表位完整度却不及真核表达产物;而真核表达的山羊 IFN- 蛋白, 表达量低、难于纯化, 不符合免疫小鼠的抗原要求。本试验分离培养了山羊外周血淋巴细胞, 用 con-A 刺激淋巴细胞产生天然山羊 IFN-, 验证了所获单克隆抗体既可识别原核表达山羊 IFN-, 又可识别天然山羊 IFN-10。单克隆抗体的制备过程中, 有很多关键
21、性因素, 如免疫小鼠用的抗原中杂蛋白过多, 会造成脾脏内针对杂蛋白活化的淋巴细胞过多, 导致阳性率偏低, 也为筛选增加了工作难度。因此, 在单克隆抗体制备过程中, 免疫小鼠的抗原应纯化到最大程度。图 3 杂交瘤细胞染色体数目分析 Fig.3 Analysis of hybridoma chromosomenumbers 下载原图参考文献1赵燕清.奶山羊隐性乳腺炎的流行病学调查及 S.aureus 感染小鼠乳腺后 Th细胞免疫应答机制研究D:陕西杨凌:西北农林科技大学, 2015. 2Boshra H, Truong T, Nfon C, et al.A lumpy skin disease v
22、irus deficient of an IL-10gene homologue provides protective immunity against virulent capripoxvirus challenge in sheep and goatsJ.Antiviral Res, 2015, 123:39-49. 3安贝.山羊 IFN- 基因的克隆表达及抗 ORFV 活性鉴定D:陕西杨凌:西北农林科技大学, 2014. 4刘鹤媛, 周铭, 岳进华, 等.山羊 IFN- 免疫血清制备及抗体 ELISA 检测方法的建立J.动物医学进展, 2016, 37 (12) :24-27. 5Li
23、u Y, Li X, Li Z, et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against infectious bursal disease virus (IBDV) VP4J.Shengwu Gongcheng Xuebao, 2014, 30:1660-1668. 6Hao Z, Xu L, Bai Y, et al.Preparation of monoclonal antibodies against hFGF-21and identification of epitopeJ.Xibao Yu Fenz
24、i Mianyi Xue Zazhi, 2013, 29:834-837. 7Zhou J, Zhao L, Hu J H, et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against recombinant N protein of mouse hepatitis virusJ.Xibao Yu Fenzi Mianyi Xue Zazhi, 2012, 28:841-843. 8Yang Y, Ma Y, Li H, et al.Preparation and identification of monoclonal antibodies against omega-conotoxin MVIIAJ.Monoclonal Antibodies Immunodiagnosis Immunotherapy, 2014, 33:254-260. 9金标.山羊干扰素- 与白细胞介素-2 的克隆、原核表达及其抗血清的制备D.黑龙江哈尔滨:东北农业大学, 2007. 10李川, 谭亚娣, 陈颖钰, 等.牛 IFN- 原核表达、单克隆抗体制备及其ELISA 检测方法的建立J.生物工程学报 2007, 23:40-45.
