1、大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 黄谧 冯勇 武汉大学基础医学院 湖北华大基因研究院 摘 要： 根据大鲵虹彩病毒 (Chinese giant salamander iridovirus, GSIV) 主要衣壳蛋白 (Major Capsid Protein, MCP) 基因设计引物, PCR 扩增得到 MCP 基因编码框全长序列 1 392 bp, 将其克隆到原核表达载体 p ET-32a 中, 构建了重组原核表达载体 p ET-32a-MCP, 并在大肠杆菌 BL21 中得到了表达, 融合表达的重组蛋白分子量约为 70 ku, 与预期大小一致, 主要以包涵体的形式存在。对
2、IPTG 浓度, 诱导温度等诱导表达条件进行优化, 确定 0.5 mmol/L 的 IPTG 于37的条件下诱导 6 h 重组蛋白的表达量最佳。纯化 GSIVMCP 重组蛋白免疫新西兰大白兔, 制备了 GSIV-MCP 多克隆抗体, ELISA 检测抗体效价大于 150 000。Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明, 该多克隆抗体可与由 GSIV 感染引起细胞病变的 EPC 细胞 (GICB) 发生特异性的结合。研究为建立 GSIV 免疫诊断方法以及为研究 GSIV MCP 基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。关键词： 大鲵虹彩病毒; 衣壳蛋白;
3、原核表达; 多克隆抗体; 免疫检测; 作者简介：黄谧 (1987-) , 女, 湖北荆州人, 助理研究员, 主要从事生物医学工程研究, (电话) 13797025720 (电子信箱) ;作者简介：冯勇, (电子信箱) 。收稿日期：2017-09-14Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of the Major Capsid Protein of Chinese Giant Salamander IridovirusHUANG Mi FENG Yong Wuhan University School of Basi
4、c Medical Science; Abstract： According to major capsid protein (MCP) gene of chinese giant salamander iridovirus (GSIV) , primers were designed, and MCP gene coding frame full-length sequence (1 392 bp in length) was amplified by PCR and then cloned into prokaryotic expression vector p ET-32 a, to c
5、onstruct the recombinant expression vector p ET-32 a-MCP. The recombinant expression vector p ET-32 a-MCP was successfully expressed in E.coli BL21 as a fused recombinant protein with a size of 70 k u equal to the expected size, and presented mainly in inclusion body. The optimum induction condition
6、 for expression of the recombinant protein was 0.5 mmol/L IPTG, 37 , 6 h. The purified recombinant proteins were used to immune New Zealand white rabbits to produce polyclonal antibody, the titers of polyclonal antibodies was above 1 50 000 by ELISA. Western blot test demonstrated that the recombina
7、nt protein was recognized by the polyclonal antibody. An indirect immunofluorescent assay also showed that the polyclonal antibody was able to interact specifically with the pathological EPC cells (GICB) induced by GSIV infection. The conclusions made a preparations for the establishment of GSIV imm
8、unodiagnosis and the study of GSIV MCP gene coding protein functions.Keyword： Chinese giant salamander iridovirus (GSIV) ; Capsid protein; prokaryotic expression; polyclonal antibodies; immunoassay; Received： 2017-09-14中国大鲵 (Andrias davidianus) 是现存个体体型最大的两栖动物, 俗名娃娃鱼, 是中国珍贵特产水生动物, 属于国家二级保护动物, 在中国部分地区
9、成功实现了人工养殖。陕西、湖北、湖南、浙江、贵州等省份的大鲵主养区近年暴发了大鲵病毒性出血病, 该病可感染各种规格的养殖大鲵, 死亡率高达 90%以上, 给大鲵养殖业造成了巨大的损失。大鲵病毒性出血病的病原为大鲵虹彩病毒 (Chinese giant salamander iridovirus, GSIV) , 是虹彩病毒科 (Iridoviridae) 蛙病毒属 (Ranavirus) 的成员1-3。虹彩病毒 (Iridoviruses) 是一类病毒粒子较大, 呈二十面体状的双链 DNA 病毒4。虹彩病毒科 (Iridoviridae) 分为 5 个属 绿虹彩病毒属 (Chloriridov
10、irus) 、虹彩病毒属 (Iridovirus) 、淋巴囊肿病毒属 (Lymphocystivirus) 、巨大细胞病毒属 (Megalocytivirus) 和蛙病毒属 (Ranavirus) 5,6。虹彩病毒可感染无脊椎动物 (绿虹彩病毒属, 虹彩病毒属) 及变温脊椎动物 (蛙病毒属, 淋巴囊肿病毒属, 巨大细胞病毒属) , 包括两栖类、爬行类、甲壳类、软体动物、昆虫及鱼类等。脊椎动物虹彩病毒, 尤其是蛙病毒属的一些成员已经成为导致变温动物发病的一个重要原因7,8。主要衣壳蛋白 (Major capsid protein, MCP) 是虹彩病毒二十面体衣壳的主要结构蛋白, 为一个单一的多
11、肽, 其分子量约为 50 ku, 占病毒总蛋白量的 45%, 占病毒可溶性蛋白的 90%9,10。MCP 基因在同属间具有高度的保守性, 不同属间具有足够的差异性, 是研究虹彩病毒分类及系统演变的靶基因。本研究将GSIV 主要衣壳蛋白在大肠杆菌 BL21 中进行了融合表达, 并将其纯化, 制作多克隆抗体, 为大鲵病毒性疾病的防治及 GSIV 的免疫检测试剂盒的研制奠定一定的基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 毒株、细胞系、菌株与质粒大鲵虹彩病毒由武汉大学基础医学院实验室分离鉴定;鲤上皮瘤细胞系 (Epithelioma papilloma cyprini, EPC) 由武汉大学中国典型
12、培养物保藏中心保藏, 保藏号 CCTC-CGDC0174;原核表达载体 p ET-32a、表达菌株 BL21 (DE3) 购于 Novagen 公司;p MD19-T 载体购于 Ta Ka Ra 公司。1.1.2 主要试剂及仪器限制性内切酶 Eco R、Hind (Promega) , T4 DNA 连接酶 (Taka Ra, T4DNA Ligase) , HRP 标记的羊抗兔 Ig G (ABCLONAL BIOTECHNOLOGY, INC.) , 病毒DNA 提取试剂盒 (OMEGA, Viral DNA Kit) , 胶回收试剂盒 (OMEGA, Gel Extraction Kit
13、) , 质粒提取试剂盒 (Promega, Pure Yield TM Plasmid Midiprep System) , 免疫荧光染色试剂盒 (碧云天, 免疫荧光染色试剂盒抗兔 Cy3) , 化学发光底物 (Thermo, Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate) 。离心机 (Sigma, 3K-15) , 化学发光成像与分析系统 (Bi O-RAD, Chemi Doc XRS+) , PCR 仪 (Biometra, T-professional) , 低温恒温槽 (上海恒平科学仪器有限公司) , 小型垂直电泳槽 (Bi O-
14、RAD, Mini-PRO-TEAN 誖 Tetra System) , 酶标仪 (Bi O-RAD, i Mark ) , 半干转印槽 (Bi O-RAD, TRANS-BLOT 誖 SD) , 倒置荧光显微镜 (LEICA, DFC420C) 。1.1.3 引物上游引物, 5-CGGAATTCATGTCTTCTG TAACCG-3含有 Eco R酶切位点;下游引物, 5-CC AAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3含有 Hind酶切位点。1.2 MCP 基因的克隆GSIV 接种至 EPC 细胞, 当细胞出现典型病变时, 冻融病变细胞 3 次, 将培养瓶中的悬浊液利用病毒 DNA
15、 提取试剂盒抽提 GSIV 核酸, 以抽提产物为模板, 进行PCR 扩增。采用 50L 反应体系, 10PCR Buffer 5L, d NTP (10 mmol/L) 1L, Primers (F/R, 10mol/L) 各 1L, r Taq DNA 聚合酶 (5 U/L) 1L, DNA 模板为 0.5L, dd H 2O 补足至 50L。PCR 扩增程序为 95预变性 5 min;94变性 1 min, 55退火 1 min, 72延伸 1 min, 30 个循环;72延伸10 min。PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后, 经胶回收试剂盒回收目的片段, 将纯化的的 MCP 基
16、因与 p MD19-T 载体于 16连接 4 h 后, 转化到大肠杆菌 DH5 感受态细胞中, 筛选阳性克隆, 命名为 p MD19-T-MCP, 送上海生工生物工程有限公司测序。1.3 重组表达载体的构建重组质粒 p MD19-T-MCP 与原核表达载体 p ET-32a 分别由 Eco R和 Hind双酶切, 经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后, 通过胶回收试剂盒回收目的片段, 用 T4 DNA 连接酶 16连接过夜, 转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 感受态细胞中, PCR 筛选阳性克隆, 扩大培养后提取质粒, 经酶切鉴定后, 命名为 p ET-32a-MCP, 送上海生工生物工程有限
17、公司测序。1.4 重组蛋白的表达及表达形式的分析将培养过夜的阳性重组菌 p ET-32a-MCP/BL21 以 1100 的比例接种到 LB 液体培养基 (含 50g/m L Amp) 中, 37200 r/min 振荡培养至菌液 OD600 nm为0.40.6 时, 取 2 m L 菌液作为诱导菌的对照, 然后加入终浓度为 1 mmol/L 的IPTG 诱导 4 h 后, 取 2 m L 诱导菌液及上述对照菌液 45 000 g 离心 5 min收集菌体, 用 100L PBS 重悬菌体, 加入等量的 SDS-PAGE 上样缓冲液, 沸水中处理 10 min, 取 10L 进行 SDS-PA
18、GE 分析。取诱导后的菌液进行超声破碎处理, 45 000 g 离心 5 min 取上清及沉淀分别进行 SDS-PAGE 分析。1.5 重组蛋白表达条件的优化及纯化将培养过夜的阳性重组菌 p ET-32a-MCP/BL21 以 1100 的比例接种到 LB 液体培养基 (含 50g/m L Amp) 中, 37200 r/min 振荡培养至菌液 OD600 nm为0.40.6 时, 加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG, 于加入 IPTG 的后的0、2、4、6、8 h 分别取样, 进行 SDS-PAGE 分析, 以确定最佳诱导时间。在最佳诱导时间下, 分别加入 1.0、0.5、0.1、
19、0 mmol/L 的 IPTG, 以确定最佳的IPTG 浓度。经过诱引的重组菌株经超声波破碎处理, 离心去上清液, 沉淀溶解在适量的磷酸钠缓冲液 (含 8 mol/L 尿素) 中, 然后参照蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化。1.6 重组蛋白多克隆抗体的制备及检测取纯化后的重组蛋白 2 m L 采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔 (免疫前采集正常血清作为阴性对照) , 以后每 2 周加强免疫 1 次, 共 4 次。首次免疫加入与重组蛋白等量弗氏完全佐剂, 后 3 次加入与重组蛋白等量弗氏不完全佐剂。末次加强免疫后 7 d 心脏采血, 分离血清。抗血清经抗原亲和纯化得到纯化的多克隆抗体。用纯化的
20、GSIV-MCP 重组蛋白为抗原, 以每孔 100g 的浓度 4包被 96 孔板, 待测多克隆抗体为一抗, 按 11 000, 12 000, 14 000, 18 000, 116 000, 132 000, 164 000, 1128 000, 1256 000, 1512 000 的比例稀释待测多抗, 将注射佐剂加 PBS 的阴性血清以 11 000, 14 000 稀释作为阴性对照。用 HRP 标记的羊抗兔 Ig G 为二抗, 以四甲基苯胺 (TMB) 溶液显色后用酶标仪测定 OD450 nm, 以确定抗体效价。将诱导表达的重组菌 p ET-32a-MCP/BL21 进行进行 SDS-
21、PAGE 电泳后, 转移至硝酸纤维素膜上, 用含有 20g/L BSA 的 PBST (含有终浓度为 0.05%的 Tween-20) 室温封闭 1 h, 用制备的 GSIV-MCP 抗体室温孵育 1 h, PBST (含有终浓度为 0.05%的 Tween-20) 洗膜后, 用 HRP 标记的羊抗兔 Ig G 抗体室温孵育 1 h, 再次清洗, 最后用化学发光底物工作液孵育 5 min 显色。同时用未经诱导表达的重组菌 p ET-32a-MCP/BL21 作为对照进行相同操作。1.7 间接荧光免疫检测 GSIV以纯化的 GSIV-MCP 多克隆抗体为一抗, 红色荧光探针标记的羊抗兔 Ig G
22、 (H+L) 抗体为二抗, 参照免疫荧光染色试剂盒 (碧云天, 免疫荧光染色试剂盒-抗兔Cy3) 对感染 GSIV 的 EPC 进行检测。同时用没有感染 GSIV 的 EPC 作为对照进行相同操作。2 结果与分析2.1 MCP 基因的克隆利用引物经 PCR 反应从抽提的病毒总 DNA 中扩增出目的片段, 经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析片段大小为 1 400 bp, 其分子量与预期大小一致, 结果见图 1。胶回收 PCR 产物, 连接 p MD19-T 载体, 转化大肠杆菌感受态细胞, 获得了阳性重组菌株 p MD19-T-MCP/DH5, 测序结果表明成功克隆了大小为 1 392 bp 的目的
23、片段至 T 载体中。图 1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 下载原图M.DL2000 DNA Mark;1.PCR 产物2.2 重组表达载体的构建及鉴定经 Eco R和 Hind双酶切的 p ET-32a, 与 MCP 基因连接后, 转化大肠杆菌BL21 感受态细胞, PCR 鉴定获得了阳性重组菌株 p ET-32a-MCP/BL21。提取重组质粒经 Eco R和 Hind双酶切鉴定, 琼脂糖凝胶电泳结果表明双酶切得到的目的片段以及 PCR 鉴定阳性克隆的产物均与预期大小的核酸片段相同, 结果见图 2。测序结果进一步证明 MCP 基因被正确地插入到 p ET-32a 载体上, 成功构建了重组表达载
24、体。图 2 重组质粒 p ET-32a-MCP 酶切、PCR 鉴定结果 下载原图1.p ET-32a-MCP 重组质粒;2.经 Eco R和 Hind双酶切的重组质粒;3.PCR 鉴定阳性克隆产物;M.DL2000 DNA marker2.3 重组蛋白的表达及表达形式的分析SDS-PAGE 分析表明重组菌株 p ET-32a-MCP/BL21 经 1 mmol/L 的 IPTG 于 37的条件下诱导 4 h, 能有效地诱导重组菌株的表达, 蛋白分子质量约为 70 ku, 与预期大小一致。诱导表达的菌体通过超声破碎处理后, 表达产物主要存在于超声破碎后的沉淀中, 说明表达的蛋白主要以包涵体形式存
25、在。结果见图 3。图 3 表达融合蛋白的 SDS-PAGE 分析 下载原图M.蛋白分子量标准;1.未诱导;2.诱导;3.超声上清;4.超声沉淀2.4 重组蛋白表达条件的优化及纯化重组菌株 p ET-32a-MCP/BL21 用 1 mmol/L 的 IPTG 于 37的条件下分别诱导0、2、4、6、8 h, 重组蛋白的表达量以诱导时间为 6 h 为最佳, 结果见图 4。以 1.0、0.5、0.1、0 mmol/L 的 IPTG 于 37的条件下诱导 6 h, 以 0.5 mmol/L 的 IPTG 诱导重组蛋白的表达量最大, 结果见图 5。因此初步确定重组菌株 p ET-32a-MCP/BL2
26、1 融合表达重组蛋白的最佳条件为 0.5 mmol/L 的 IPTG 于37的条件下诱导 6 h。重组蛋白经蛋白纯化试剂盒的纯化得到了高纯度的可溶性蛋白质。结果见图 6。经 Bradford 法测定并调整蛋白质的浓度为 250g/m L。图 4 重组菌株 p ET-32a-MCP/BL21 不同诱导时间的 SDS-PAGE 分析 下载原图M.蛋白质分子量标准;1-5.p ET-32a-MCP/BL21 分别诱导 0、2、4、6、8;6.BL21诱导 8 h;7.p ET-32a/BL21 诱导 8 h图 5 重组菌株 p ET-32a-MCP/BL21 不同 IPTG 浓度的 SDS-PAGE
27、 分析 下载原图M.蛋白质分子量标准;1-4.1.0、0.5、0.1、0 mmol/L 的 IPTG图 6 纯化的重组蛋白验证 下载原图M.蛋白质分子量标准;1.纯化后的重组蛋白2.5 重组蛋白多克隆抗体的制备及检测收集经过 4 次免疫的新西兰大白兔抗血清, 抗血清经抗体亲和纯化得到纯化的多克隆抗体, 浓度为 3 mg/m L。经 ELISA 法测定, 抗体效价大于 150 000。Western blot 结果表明, GSIV-MCP 多克隆抗体能特异性识别重组蛋白。结果见图 7。图 7 重组蛋白的 Western blot 分析 下载原图M.蛋白分子量标准;1.未诱导;2.诱导;3.未诱导
28、的 Western blot 检测;4.诱导的Western blot 检测2.6 间接荧光免疫检测 GSIV间接荧光免疫结果显示, 感染 GSIV 的 EPC 细胞在绿光激发下呈现出鲜光的红色, 并且随着病毒感染时间的增加, 红色荧光的强度增加;没有感染 GSIV 的 EPC 细胞则没有红色荧光出现。说明制备的 GSIV-MCP 多抗能够特异性地检测 GSIV。结果见图 8。3 讨论大鲵病毒性出血病是近年暴发的一种传染病, 可感染各种规格的养殖大鲵, 发病大鲵体表具有典型的出血症状, 后肢肿大或溃疡, 解剖发现内脏器官出血或坏死, 其死亡率可达 90%以上。大鲵病毒性出血病的病原为大鲵虹彩病
29、毒。虹彩病毒是一类病毒粒子较大的胞浆型 DNA 病毒, 是水生动物的一类主要病原。在中国已经从甲鱼11、云斑尖塘鳢12、条石鲷13、大口黑鲈14,15、虎纹蛙蝌蚪16等多种水生动物体内检测出虹彩病毒。图 8 免疫荧光检测 EPC 细胞中的 GSIV 下载原图A 列.白光下的 EPC 细胞;B 列.绿色荧光下的 EPC 细胞;ctrl.模拟感染 GSIV 的EPC 细胞;12 h、24h、36 h.GSIV 感染 12、24、36 h 的 EPC 细胞虹彩病毒的衣壳呈二十面体结构, 由六面体状的衣壳亚单位构成。衣壳亚单位又称主要衣壳蛋白 (Major capsid protein) , 其数量与
30、病毒粒子的大小有关。MCP 基因为虹彩病毒的一个晚期基因, 在虹彩病毒感染的晚期大量表达, 编码的主要衣壳蛋白分子量约为 50 ku, 构成病毒的二十面体衣壳10,17。比较虹彩病毒 MCP 基因的氨基酸序列发现, 虹彩病毒 MCP 基因的氨基酸序列是高度保守的, 同一属的同源性一般在 90%以上, 不同属之间的同源性一般为40%50%17。本研究中将大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白 (GSIV-MCP) 基因克隆至原核表达载体p ET-32a 中进行了融合表达, 表达的重组蛋白的分子量约 70ku。由于 p ET-32a 原核表达载体, 含有一段编码硫氧还蛋白的序列 (编码 109 个氨基酸) 、6
31、个组氨酸标签序列及一个 S 标签序列 (编码 15 个氨基酸) 与目的蛋白融合表达, 因此重组蛋白的分子量比目的蛋白大 20.4 ku。目的基因与 p ET-32a 融合表达这不仅提高了表达产物的稳定性, 而且便于纯化和鉴定, 同时又不影响目的蛋白的免疫原性。重组表达载体 p ET-32a-MCP 经诱导条件的优化, 在大肠杆菌BL21 中得到了高效表达。结果表明, 0.5 mmol/L 的 IPTG 于 37的条件下诱导6 h 重组蛋白的表达量最佳。重组蛋白主要以包涵体形式存在, 包涵体的形成便于重组蛋白的纯化。包涵体经磷酸钠缓冲液 (含 8 mol/L 尿素) 溶解、蛋白纯化试剂盒纯化得到
32、了高纯度的可溶性蛋白。以此蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗血清, 抗血清经过抗体亲和纯化得到纯度较高的多克隆抗体。Western blot 得到一条与预期大小一致蛋白杂交带, 说明 GSIV-MCP 多克隆抗体特异性较好, 纯度较高。间接荧光免疫结果表明, GSIV-MCP 多克隆抗体能特异性的检测 GSIV, 说明制备的 GSIV-MCP 多克隆抗体能够满足 GSIV 免疫检测的要求。将 GSIV 主要衣壳蛋白在大肠杆菌 BL21 中进行了融合表达, 并将其纯化, 制作多克隆抗体, 这将为大鲵病毒性疾病的防治及 GSIV 的免疫检测试剂盒的研制奠定一定的基础。参考文献1耿毅, 汪开毓, 李成伟,
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