1、以 LasR蛋白为靶标的群体感应活性物 质虚拟筛选及鉴定 刘颖 石静 熊亚南 华北理工大学医院 华北理工大学基础医学院 摘 要： (1) 目的 通过计算机虚拟筛选得到新型群体感应活性物质, 并对其进行活性评 价。 (2) 方法以铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa, PA) 群体感应系统 受体蛋白LasR为研究对象, 从Zinc化合物库中筛选出34个与LasR蛋白结合较 好的化合物, 并对其中 2个化合物 (AZINC02316089 (STL038792) 、 CZINC01130988 (STK135354) ) 在不影响 PA生长的浓度范围内, 利用RT-PCR
2、检测与QS调控相关基因的表达影响, 及对 PA质控菌株和临床分离株弹性蛋白 酶、生物膜形成的作用。 (3) 结果 虚拟筛选所得的得分较高化合物在不影响 PA生长的浓度范围内, 能够降低多种QS调控相关基因的表达, 并能对 PA弹性 蛋白酶、生物膜形成和动力作用产生影响。 (4) 结论 从ZINC数据库中发现了 两种具有群体感应抑制活性的化合物, 为进一步探索研发新型抗菌药物奠定基 础。 关键词： 铜绿假单胞菌; 群体感应系统; 虚拟筛选; 活性鉴定; 作者简介：刘颖 (1982-) , 女, 硕士, 主管药师。研究方向:病原生物学。 Virtual screening and identifi
3、cation for quorum sensing inhibitors in pseudomonas aeruginosa LIU Ying SHI Jing XIONG Yanan North China University of Science and Technology; Abstract： Objective To obtain a new type of quorum sensing active substance by computer virtual screening.Methods Pseudomonas aeruginosa quorum sensing syste
4、m receptor protein LasR as the research object, screened out 34 better compounds with LasR protein from the ZINC compound library, and detecte 2 of them the effect of expression of QS genes by RT-PCR without affect the growth of PA concentration range, and the PA quality control strains and clinical
5、 isolates of elastase activity, and the effects of the biofilm formation.Results The higher score of virtual screening compounds without affecting the concentration range of the growth of PA, could reduce the expression of multiple QS genes, affected elastase of PA, also the biofilm formation and dy
6、namic action.Conclusion Two kinds of compounds with quorum sensing inhibitory activity are found in the ZINC database, which lay the foundation for further research and development of new antibacterial drugs. Keyword： Pseudomonas aeruginosa; Quorum sensing system; Virtual screening; Activity identif
7、ication; 随着病原菌对现有抗生素产生耐药性的问题受到广泛关注, 传统的抗菌药物已 经不能满足临床需求, 寻求一种抗菌新策略已成为全球范围内亟待解决的公共 问题。 若有一种物质, 能够在不抑制病原菌生长的前提下, 减弱其致病毒性, 即 不威胁病原菌自身的生存, 则不会引起耐药性问题。 研究人员将目光从“抗菌” 转移到“抗发病机制”上来, 为我们提供了一种抗菌新策略1。 铜绿假单胞菌 (PA) 是一种在临床上常见的机会致病菌, 可引起泌尿系统、 呼吸 系统、慢性创伤、软组织等多种系统的感染, 在严重烧伤、癌症和免疫缺陷患者 中, 尤为严重。应用现有抗生素治疗 PA感染的过程中, 耐药性的产
8、生已成为一 个不容忽视的问题2。 群体感应系统广泛存在于细菌中, 当细菌密度达到一定程度时, 细菌自身合成、 释放某种信号分子, 能够启动相关基因的表达, 调控细菌的多种生物行为, 诸 如生物发光、产生毒素、形成生物膜、产生抗生素等3。群体感应系统在 PA 毒力因子产生及生物膜形成方面有着重要的调节作用。PA的群体感应调控网络 相当复杂, 包括基于酰化高丝氨酸内酯 (AHLs) 的LasI/LasR和RhlI/RhlR信号 系统和基于2-烷基-4 (1H) -喹诺酮 (AHQ) 的喹诺酮信号系统等4。鉴于LasR 系统在PA群体感应系统中的重要作用, 本研究选取LasR作为靶蛋白, 利用计算机
9、虚拟筛选的方法, 从ZINC数据库化合物3500多万个小分子化合物中, 筛选得 到了34 个打分高的化合物。综合化合物的稳定性、成药性、分子量大小等因素, 选取ZINC02316089 (STL038792) 、ZINC01130988 (STK135354) 作为目标化合 物进行活性检测。 1 材料与方法 1.1 材料 计算机, 生物数据库 (NCBI, PDB等软件) :Open Babel;Mgltools AutoDock Vina 软件;Discovery Studio Viewer 3.5 等;LasR 蛋白数据来自蛋白晶体数据库 5http:/www.pdb.org/pdb/ho
10、me/home.do (PDB ID:2UVO) ;供虚拟筛选的数据 库为ZINC 数据库 (https:/zinc.docking.org/) 菌株:PA质控菌株 (ATCC27853) (开滦总医院微生物实验室保存) ;PA临床分离株 (使用细菌鉴定 及药敏测定仪对临床分离菌株进行重新鉴定。选取开滦总医院某患者 PA临床分 离株分纯培养用于本研究) 。 1.2 培养基 LB液体培养基:蛋白胨 1%, 酵母粉0.5%, NaCl1%, pH7.0。 Swarming培养基:8.6mMNaCl 0.2492g, 20mMNH4Cl 0.525g, 22mMKH2PO41.496g, 12mMN
11、a2HPO47H2O 2.149g, 0.4%琼脂糖琼脂粉 2.0g, 11mM葡萄糖1.98g, 0.5% 酸水解干酪素2.5g, 1mMMgSO47H2O 0.123g, 1mMCaCl20.0735g。 1.3 试剂 ZINC02316089 (STL038792) 、ZINC01130988 (STK135354) 购自Vitas-M Laboratory 1.4 方法 1.4.1 群体感应活性物质的虚拟筛选 从蛋白晶体数据库 http:/www.pdb.org/pdb/home/home.do (PDB ID:2UVO) 中 检索LasR 蛋白数据, 从ZINC数据库 (https:
12、/zinc.docking.org/) (截止到 2015年 5月, 已收录的全部化合物超过 3.5 千万个) 中, 利用计算机分子对接 技术通过AutoDock Vina 软件将每个处理好的 ZINC数据库中的化合物与 LasR 的活性中心进行对接, 筛选与LasR蛋白具有高亲和力的化合物。选取购买得分 较高的化合物进行活性检测。 1.4.2 qRT-PCR检测A、C化合物对QS调控相关基因 (LasR、LasI、LasB) 表达 的影响 1.4.2. 1 PA 质控菌株及临床分离菌株 cDNA准备 采用倍比稀释的方法确定 A、C 化合物在400M-6400M浓度范围内不影响 PA 生长,
13、分别配置 400M 的A、C化合物的LB 培养基, 将400MA及 C化合物分 别放入0.5麦氏浊度的PA标准菌株及临床分离菌株的5mL LB培养基中, 并设置 空白对照组, 将复苏好的 PA质控菌株和临床分离株分别调整至 0.5 麦氏比浊标 准, 经 LB肉汤1:1000 稀释后, 吸取100L 至含有4种化合物的LB 培养基中, 同时吸取100L至不含有 4种化合物的LB 培养基中, 37, 220rpm 培养至对 数期。菌液收集并处理提取 8种总RNA并反转录成cDNA。 1.4.2. 2 qRT-PCR检测A、C化合物对QS调控相关基因 (LasR、LasI、LasB) 的 表达 由生
14、物公司设计引物 (做溶解曲线, 以验证引物的特异性) , 具体序列见表 1, 扩增LasR、LasI、LasB目的基因, 并将b-actin作为内参基因, 将 cD-NA进行 适当稀释, 进行梯度 qPCR检测。操作体系:RNase Free dH20 9.5L, cDNA/DNA1L, 上下游引物各 1L, 2xGoldStar Taq MasterMix12.5L。反应 程序, 三步法:预变性 95, 3 分钟;变性95, 10 秒;退火5560, 30 秒; 延伸72, 30 秒, 共40个循环;终延伸72, 10 分钟。 表1 引物序列 下载原表 1.4.3 A、C化合物对 PA 毒力
15、因子影响检测 1.4.3.1 对 PA 弹性蛋白酶活性检测 分别挑取PA质控菌株和临床分离株于新鲜的 LB液体培养基中, 37, 150rpm 摇床过夜培养;用新鲜LB液体培养基将培养至对数期的菌液以1:100比例稀释后, 将每种菌液分装5组, 每组3个平行, 向其中加入终浓度为 0、 400M 的A化合 物、400M 的C化合物, 37、150rpm摇床培养 12小时;吸取1mL 菌体, 4、 12000rpm离心15分钟, 小心吸取200L上清液于 2mL eppendorf 管中;加入 800L反应缓冲液以及 3mg刚果红底物, 30恒温振荡反应10小时;加入11mM 葡萄糖0.9911
16、克, 4、12000rpm离心15 分钟, 除去未反应的刚果红底物;吸 取10L 上清液, 酶标仪检测其在 490nm处吸光度。 1.4.3. 2 PA 生物被膜活性检测 分别挑取 PA质控菌株和临床分离株于新鲜的 LB液体培养基中, 37, 150rpm 摇床过夜培养;用新鲜 LB液体培养基将培养至对数期的菌液以 1:100 比例稀释, 培养1小时。 将每种菌液分装5组, 每组3个平行;向其中加入终浓度为0、 300M 的A化合物、300M 的C化合物。分装入96 孔板, 每个孔150L, 于37静 置下培养20小时;使用移液器轻轻吸出菌液, 注意不要是枪头碰到孔底与孔壁, 使用PBS缓冲液
17、轻轻洗涤96孔板2次, 风干;每孔加入150L的0.1%结晶紫溶液染色15分钟, 再加入 150L的PBS缓冲液轻轻洗涤 3次, 风干;加入 10L33%的冰乙酸溶解, A595测定其吸收值。 2 结果 2.1 PA 群体感应活性物质的筛选 虚拟筛选得到了34 种结合能得分较高的配体, 综合化合物的稳定性, 成药性, 分子量大小等因素, 从中选取AZINC02316089 (STL038792) 、CZINC01130988 (STK135354) 作为目标化合物进行活性检测, 见表2。 表2 目标化合物的性质 下载原表 2.2 RT-PCR检测A、C化合物对QS调控相关基因表达的影响 A、C
18、化合物减少了 PA质控菌株及临床分离株的 LasR、LasI、LasB 基因的表达, 结果见图1、图2。 图1 A化合物对PA质控菌株及临床分离菌株的毒力基因表达影响 下载原图 图2 C化合物对PA质控菌株及临床分离菌株的毒力基因表达影响 下载原图 2.3 A、C化合物对 PA弹性蛋白酶影响 A、C化合物减少了 PA菌株的弹性蛋白酶的产生, 见图3。 2.4 A、C化合物对 PA生物被膜的影响 A、C化合物减少了 PA菌株的生物被膜的产生, 见图4。 图3 A、C化合物的加入对 PA质控菌株及临床分离株的弹性蛋白酶影响 下 载原图 图4 A、C化合物的加入对 PA质控菌株及临床分离株的生物被膜
19、影响 下载 原图 3 讨论 群体感应系统在多种细菌中普遍存在, 系统间呈级联调控, PA的致病性和耐药 性受到群体感应系统的影响6。当细菌数量到一定程度, 首先激发 Las系统的 启动, 3-oxo-C12-HSL 与LasR结合形成复合物, 进而引起诸如弹性蛋白酶、溶 血素、外毒素A等多种毒力因子基因的表达, 并对Rhl系统、PQS系统进行正向 调节。 鉴于LasR系统的重要性, 本文选取LasR 蛋白作为靶蛋白, 进行虚拟筛选 得到了34种得分较高的化合物, 购买化合物 A和B对PA进行生物活性评价。 本文利用实时荧光定量 PCR这一分子研究中的重要工具, 对PA质控菌株及临床 分离株在分
20、别加入两种目标化合物的前后进行 LasR系统相关基因进行转录水平 的活性比较, 所加入的化合物浓度都在不影响细菌正常生长的浓度范围内进行。 与空白相比, 加入 B化合物对LasR相关的三种基因 LasR、LasB、LasI 在两株菌 种均表现下调;加入A化合物只有在临床分离株LasI中表现上调, 其余都表现下 调。 说明本次筛选结果中得分较高的化合物与靶蛋白作用, 对下游相关基因的表 达产生了抑制作用。计算机虚拟筛选作为高效、低成本的一种化合物筛选手段, 可作为初筛为我们设计研发药物提供方便。 PA的群体感应系统由多条通路组成, 系统之间的级联调控机制错综复杂7, 不仅如此, 群体感应系统与毒
21、力因子之间的对应关系也是交错的8。接下来的 细菌表型实验中, 质控菌株及临床分离株在分别加入化合物之后, 弹性蛋白酶 活性均有所下降, 这与化合物在转录水平的表现相一致。 弹性蛋白酶的形成主要 受到LasB的调节, 本研究中, 二者的高度一致性进一步证明弹性蛋白酶与LasB 的关系极为密切。 在生物膜形成影响实验中, 生物膜的形成与分别加入化合物之 间并无一致性, 甚至在临床分离株中, 加入化合物反而使生物膜形成加强, 说 明影响生物膜形成的因素较为复杂, 单纯与 LasR蛋白作用, 对生物膜的影响效 果不明显。 PA有超过10%的基因调节与其群体感应系统有关9, 这一系统能够调控PA毒力 因
22、子的产生而目前尚未发现对人体有任何影响。 因此, 通过对信号分子的化学修 饰、天然产物中分离筛选、高通量筛选等多种途径研发群体感应活性抑制剂可作 为抗菌新策略应用于人体10。计算机虚拟筛选具有成本低、高效的优点, 将该 技术应用于群体感应抑制剂的研究具有可行性。 参考文献 1Givskov M, Rasmussen TB.Quorum-sensing inhibitors as anti-pathogenic drugsJ.Int J Med Microbiol, 2006, 296 (2-3) :149-161 2Zemanick ET, Sagel SD, Harris JK.The ai
23、rway microbiome in cystic brosis and implications for treatmentJ.Curr Opin Pediatr, 2011, 23:319-324 3Ng WL, Bassler BL.Bacterial quorum-sensing network architecturesJ.Annu Rev Genet, 2009, 43:197-222 4Schuster M, Lostroh CP, Ogi T, et al.Identification, timing, and signal specificity of pseudomonas
24、 aeruginosa quorum-controlled genes:A transcriptome analysisJ.Bacteriol, 2003, 185:2066-2079 5Bottomley MJ, Muraglia E, Bazzo R, et al.Molecular insights into quorum sensing in the human pathogen pseudomonas aeruginosa from the structure of the virulence regulator LasR bound to its autoinducerJ.Biol
25、 Chem, 2007, 282:13592-13600 6Williams P, Camara M.Quorum sensing and environmental adaptation in pseudomonas aeruginosa:A tale of regulatory networks and multifunctional signal moleculesJ.Curr Opin Microbiol, 2009, 12:182-191 7Xiao G, Deziel E, He J, et al.MvfR, a key pseudomonas aeruginosa pathoge
26、nicity LTTR-class regulatory protein, has dual ligandsJ.Mol Microbiol, 2006, 62:1689-1699 8Dekimpe V, Deziel E.Revisiting the quorumsensing hierarchy in pseudomonas aeruginosa:the transcriptional regulator RhlR regulates LasR-specific factorsJ.Microbiology, 2009, 155:712-723 9Schuster M, Greenberg EP.Early activation of quorum sensing in pseudomonas aeruginosa reveals the architecture of a complex regulonJ.BMC Genomics, 2007, 8:287 10Mattmann ME, Blackwell HE.Small molecules that modulate quorumsensing and control virulence in pseudomonas aeruginosaJ.Org Chem, 2010, 75:6737-6746
