1、第一章 蛋白质的结构与功能,Chapter 1 Structure and Function of Protein,蛋白质(protein)是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。,第一节 蛋白质的分子组成,Section 1 The Molecular Components of Protein,蛋白质分子中主要的元素组成是：C、H、O、N、S等。其中N元素的含量相对稳定，约为16%，故每克氮相当于6.25克蛋白质。,一、氨基酸,组成蛋白质的基本单位是氨基酸（amino acid）。如将天然的蛋白质完全水解，最后都可得到约20种不同的氨基酸。这些氨基酸中，大部分属于L-
2、氨基酸。其中，脯氨酸属于L-亚氨基酸，而甘氨酸则属于-氨基酸。,L-氨基酸的结构通式,-氨基酸的分子构型,（一）氨基酸的分类：,根据R侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸分为三大类： 1. 酸性氨基酸Glu，Asp；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。 2. 碱性氨基酸His，Arg，Lys；侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。,3. 中性氨基酸 侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷的氨基酸。可分为： a) 极性氨基酸：Tyr，Cys，Ser，Thr，Asn，Gln，Met，Trp； b) 非极性氨基酸：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe。,（二）氨基
3、酸的理化性质：,1两性解离及等电点：氨基酸分子是一种两性电解质。通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变。 氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectric point, pI）。,溶液pH值与氨基酸等电点的关系,天然蛋白质分子的20种氨基酸，以色氨酸和酪氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。,2紫外吸收性质：,3茚三酮反应：氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。可利用此性质测定氨基酸的含量。,二、肽,（一）肽键与肽链：蛋白质是由若干氨基
4、酸的氨基与羧基经脱水缩合而连接起来形成的长链化合物。一个氨基酸分子的-羧基与另一个氨基酸分子的-氨基在适当的条件下经脱水缩合即生成肽(peptide)。,肽键的形成,多肽链的形成及其方向性,两氨基酸单位之间的酰胺键，称为肽键。多肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基。多肽链具有方向性，头端为氨基端（N端），尾端为羧基端（C端）。,蛋白质与多肽的区别：,凡氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。,（二）生物活性肽：,生物体内具有一定生物学活性的肽类物质称生物活性肽。重要的生物活性肽有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。,1. 谷胱甘
5、肽（glutathione, GSH）：是一种称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸的三肽化合物。,还原型与氧化型谷胱甘肽的相互转变,Glu-Cys-Gly | S | S |Glu-Cys-Gly,谷胱甘肽分子中的巯基可氧化或还原，故有还原型（GSH）与氧化型（GSSG）两种存在形式。,2 Glu-Cys-Gly | SH,解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,谷胱甘肽的生理功用：,种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要
6、见于下丘脑及垂体分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。 神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。,2. 多肽类激素及神经肽：,第二节 蛋白质的分子结构与功能,Section 2 Molecular Structure and Function of Protein,蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。由于蛋白质的分子结构非常复杂，为了便于研究、描述和理解，故根据丹麦科学家Linderstrom-Lang的建议，人为将蛋白质的分子结构划分为
7、一、二、三、四级结构四个结构层次。,除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构，即构象（conformation）。构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。,一、蛋白质分子中的非共价键(次级键),1. 氢键：氢键(hydrogen bond)的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间，如 C=O H-N。氢键在稳定蛋白质的空间结构上起着重要的作用。但氢键的键能较低(12kJ/mol)，易被破坏。,蛋白质分子中氢键的形成,2. 疏水键：非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键
8、或疏水作用力(hydrophobic interaction)。蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。,3. 离子键：离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。,蛋白质分子中离子键的形成,4范德华氏引力（van der Waals force)：原子之间存在的相互作用力。,维系蛋白质分子构象的非共价键,二、蛋白质的一级结构
9、,蛋白质的一级结构(primary structure)是指蛋白质多肽链中通过肽键连接起来的氨基酸的排列顺序，即多肽链的线状结构。维系蛋白质一级结构的主要化学键为肽键(peptide bond)。,牛胰岛素的一级结构,胰岛素（Insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链21个氨基酸残基，B链30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。,核糖核酸酶的一级结构,一级结构是研究高级结构的基础。从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系(例）。为生物进化理论提供依据（例）。为人工合成蛋白质提供参考顺序。,测定蛋白质一级结构的主要意义：,镰刀状红细胞
10、贫血Hb -链一级结构的改变,在镰刀状红细胞贫血患者中，由于基因突变导致血红蛋白-链第六位氨基酸残基由谷氨酸改变为缬氨酸，血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状。,细胞色素c的一级结构与生物进化的关系,三、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构(secondary structure)是指蛋白质多肽链主链原子局部的空间结构，但不包括与其他肽段的相互关系及侧链构象的内容。维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。,（一）蛋白质立体结构原则：,1.由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转（图）。2. 与肽键相连的六个原子构
11、成刚性平面结构。但由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的平面结构可以作相对旋转。,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面（酰胺平面，肽单元）。,肽键平面的形成,肽键平面示意图,（二）蛋白质二级结构的类型：,蛋白质的二级结构主要包括-螺旋，-折叠，-转角及无规卷曲等几种类型。,1. -螺旋（-helix）：,-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象，其结构特征为： 为一右手螺旋； 螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为5.44埃； 螺旋以氢键维系。,影响-螺旋稳定的因素有： 极大的侧链基团（存在空间位
12、阻）； 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）； 有Pro等亚氨基酸存在（不能形成氢键）。,2. -折叠（-pleated sheet）：,-折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象，其结构特征为： 由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构； 主链骨架伸展呈锯齿状； 借相邻主链之间的氢键维系。,-折叠的平行式与反平行式排列,3. -转角（-turn）：,-转角是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为： 主链骨架本身以大约180回折; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。,4
13、. 无规卷曲（random coil）：,无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。对于特定的蛋白质分子而言，其无规卷曲部分的构象则是特异的。,核糖核酸酶分子中的二级结构,在蛋白质分子中，若干具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成具有特殊功能的结构区域，称模体（motif)，也可称为蛋白质分子的超二级结构。,模体（motif),锌指结构 (螺旋-折叠-折叠模体),转录因子MyoD的螺旋-环-螺旋模体,四、蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，也就是一条多肽链的完整的三维结构。维系三级结构的化学键主要是非共价
14、键（次级键），如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等，但也有共价键，如二硫键等。,胰岛素分子的三级结构,溶菌酶分子的三级结构,磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构,在一级结构上相距较远的氨基酸残基，通过三级结构的形成，多肽链的弯折，彼此聚集在一起，从而形成一些在功能上相对独立的，结构较为紧凑的区域，称为结构域。,结构域（domain）：,型胶原酶的结构域,五、蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构（quaternary structure)就是指蛋白质分子中亚基的立体排布，亚基间的相互作用与接触部位的布局。亚基(subunit)就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。维系蛋白质四级结构
15、的是氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。,亚基的立体排布方式,血红蛋白(hemoglobin)的四级结构,蛋白质四级结构与功能的关系变构效应,血红蛋白的变构,当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。,血红蛋白的氧饱和曲线,这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应（allosteric effect）。,蛋白质分子的结构层次,第三节 蛋白质的理化性质及其分离纯化,Section 3 The Physical and Chemical Charac
16、ters of Protein, as well as its Separation and Purification,一、蛋白质的理化性质,由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点。,（一）蛋白质的两性解离与等电点：,（二）蛋白质的胶体性质：,蛋白质分子的颗粒直径已达1100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。,蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固：,在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空
17、间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性(denaturation)。,引起蛋白质变性的因素有： 物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等； 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。,变性蛋白质的性质改变： 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,蛋白质变性的可逆性：蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性的；如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或者蛋白质具有特殊的分子结构，并经特殊处理则可
18、以复性。,核糖核酸酶的变性与复性,天然构象,蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,二、蛋白质的分离和纯化,1. 盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析（salt precipitation）。,（一）盐析与有机溶剂沉淀：,常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。,分段盐析： 半饱和硫
19、酸铵溶液可沉淀分子量较大的血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的血浆清蛋白。 因此，使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。,2. 有机溶剂沉淀蛋白质：凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。沉淀原理是： 脱水作用； 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,（二）电泳：,带电粒子在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis) 。蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。,（三）层析：,层析（ch
20、romatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。,凝胶过滤分离蛋白质,离子交换层析分离蛋白质,（四）超速离心：,利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。,三、氨基酸顺序分析,蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤：1. 分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品。2. 取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定
21、蛋白质的氨基酸组成。,蛋白质的氨基酸组成分析,3. 分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸。通常采用2,4-二硝基氟苯（DNFB）法和肼解法分别确定蛋白质的N-端和C-端氨基酸残基。,DNFB法分析N-端氨基酸残基,肼解法分析C-端氨基酸残基,4. 采用特异性的酶（如胰蛋白酶）或化学试剂（如溴化氰）将蛋白质裂解成为长短不一的若干条肽段（必须作两套）。,胰蛋白酶（trypsin)的特异裂解作用,BrCN的特异裂解作用,5. 分离纯化单一肽段。6. 使用氨基酸顺序测定仪，测定各条肽段的氨基酸顺序。一般采用Edman降解法，用异硫氰酸苯酯进行反应，将氨基酸降解后，逐一进行测定。,Edman降解法测定氨基酸序列,氨基酸自动测序仪,7. 将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较，以获得完整蛋白质分子的氨基酸顺序。,
