1、Morris 水迷宫检测动物学习记忆水平的方法学 周娇娇 阙建宇 于雯雯 陈默雷 吴梓琪 邱丽萍 朱坤杰 齐齐哈尔医学院机能实验教学中心 关键词： Morris 水迷宫; 实验方法; 作者简介：朱坤杰 (1968-) , 女, 教授, 医学博士, 主要从事神经药理学研究。作者简介：周娇娇 (1992-) , 女, 在读硕士, 主要从事精神病与精神卫生相关临床研究。基金：国家大学生创新创业项目基金项目 (No.201411230046) 阿尔茨海默病 (AD) 是现代医学的治疗难点, 也是老年医学研究的热点。是目前神经生物学和神经药理学非常重要的研究内容。Morris 水迷宫11981 年初被设
2、计并应用于学习记忆脑机制研究, 目前已成为 AD 基础研究中评价动物学习记忆的经典方法。然而在国内外现有文献中, 关于 Morris 水迷宫实验动物的选择、实验指标确定、数据统计等方面存在很大差异, 这可能造成资源的浪费和实验成本的增高, 导致实验结果和结论的偏差。研究对 Morris 水迷宫方法中动物选择、观察指标确定、实验数据统计方法、实验设备和环境、相关实验操作等问题进行对比观察, 对方法中存在的问题给予规范和说明, 为 AD 的基础研究及神经生物学和神经药理学研究中获得有效准确的 Morris 水迷宫实验数据资料, 进而获得关于动物学习记忆水平的客观评价提供参考。1 设备与环境1.1
3、实验设备Morris 水迷宫由圆形的水池、可移动位置并隐藏在水面下的平台、图像自动采集处理系统组成。国内文献报道, 水迷宫水池直径大鼠多为 160180 cm, 小鼠为 100120 cm, 高度均为 50 cm2。平台直径大鼠 12 cm, 小鼠 6 cm, 高度30 cm, 表面粗糙;国外文献所用水迷宫水池直径大鼠为 180200 cm, 小鼠为100150 cm, 高 60 cm, 平台直径大鼠为 10 cm, 小鼠 5 cm, 高度 30 cm3。训练强度相同的情况下, 水池的大小是动物学习记忆的重要因素。过小的水池使动物爬上平台的偶然性增加, 任务难度减小。过大的水池则会增加游泳路径
4、, 体力消耗过大, 爬上站台的概率减少。推荐水池大小:大鼠 180 cm, 小鼠 120 cm。水池划分为东南西北 4 个象限 (东北 NE, 东南 SE, 西南 SW, 西北 NW) , 象限池壁圆弧中点为可选的动物入水点, 平台可放在任意一个象限内 (多见 SW象限) 。图像采集分析系统记录动物游泳轨迹数据用于指标的提取及分析4。1.2 实验环境这里包括试验设备所处的环境和实验动物游泳环境。一般 Morris 水迷宫硬件设备应固定放置在有水源、光线均一、安静的环境, 这样可减少外界环境干扰所引起的实验误差, 保证实验结果的准确性。动物完成 Morris 实验需要一定的水温、光源及外界固定的
5、参照物。水温要求恒定, 大鼠的水温控制在 (251) ;小鼠的水温则一般在 2122最宜, 国外的文献报道温度在 1922范围时大鼠的游泳状态最佳3。水温对实验结果的影响很大, 水温过低会导致动物体力消耗过大, 使其游泳成绩变差或出现应激反应, 如出现腹泻, 抽搐等;而水温过高, Morris 水迷宫水池则成为天然“浴盆”, 动物出现漂浮不动的现象。实验环境的光源保证水池水面上的光线要均一, 避免光线在水面上形成有锋利转角折线, 从而干扰动物游泳轨迹, 见图 1。保证光线均一的方法是在水池周围安放布帘或照明灯, 新型的水迷宫设备在这方面已经进行了周密的设计。水中加入牛奶或者无毒染料及黑色背景的
6、布置都是为了视频追踪的需要。黑色背景建议使用。参照物包括实验室的设备、仪器、工作台、桌椅、门窗和灯具等陈设和实验操作人员, 这些都可能被实验动物看见并成为参照物为动物提供空间参考, 被称为迷宫外暗示。这些参照物如果变动会影响实验结果, 因此, 实验中要保持这些参照物的前后始终一致, 特别是实验操作人员所处的位置。图 1 光线折射所致的伪迹 (折线部分) 下载原图2 实验操作及注意事项Morris 水迷宫用来检测动物的空间学习记忆能力, 经典的实验操作包括定位航行、空间探索, 这是最常被选用做动物学习记忆评价的基本步骤;动物休息若干天后, 可用同样的方法进行定位航行和空间探索测试, 来判定动物空
7、间记忆的保持和再现能力;空间搜索试验后 24 h 将站台移至对位象限, 进行对位训练和对位探索试验, 也称附加实验, 可以考察动物的工作记忆。2.1 操作方法2.1.1 定位航行实验也称获得性训练。动物先移入实验环境适应 1 w, 实验第 1 天将鼠放入水池中自由游泳 60120 s 以适应环境, 为了避免时间过长消耗过多体力, 一般小鼠60 s, 大鼠 120 s。第 2 天起将平台置于某一象限, 进行获得性训练, 每日 4次, 4 个不同的象限各一次, 面向池壁将动物放入水中, Nature Protocols 推荐每次实验间隔时间 15 s3, 共训练 45 d, 实验观察发现, 定位航
8、行实验可根据动物状态确定每天游泳次数, 游泳次数过多会消耗动物体力导致数据失真。动物找到平台后一般在平台上休息 1015 s, 若规定时间内找不到平台, 则由操作者将其引导上平台, 在平台上休息相同时间, 再进行下一次实验。若动物未充分休息再次跳入水中则需将其重新放回站台重新计时。2.1.2 空间探索实验定位航行实验结束 24 h 后, 撤除水下平台, 任选 1 个入水点将动物面向池壁放入水中, 所有动物必须在同一入水点, 记录动物在规定的时间内 (一般为 60 s) 第一次跨越平台时间、跨越平台次数等指标。2.1.3 附加实验包括反向空间实验和二次反向空间加缩小平台实验, 将平台放在与原先平
9、台呈180的位置进行获得性训练, 24 h 后进行空间探索实验, 称反向空间实验。再次将平台放回原来象限并缩小平台重复上述实验 (平台面积可缩小至 5 cm) , 称二次反向空间加缩小平台实验。这些实验增加了实验难度, 用于考察动物的再学习能力、学习记忆的精准度或者工作记忆。近年来国外该项实验做的相对较多, 国内还很少做4。2.2 操作中注意事项2.2.1 时间的控制定位航行的天数一般控制在 45 d, 特别学习记忆障碍的年老体弱动物时间控制更重要, 体能过度消耗会给实验结果带来的误差。每次训练的时间以 60 s 为宜。有资料显示, 60 s 找不到平台的大鼠, 延长时间也很难找到, 且时间过
10、长会消耗动物更多体力5。空间搜索一般为 1 d, 将动物置于水池中搜索 60 s, 这样的过程可以重复一次。此外, 每天测试时间一致可消除不同时间动物反应性差异引起的数据波动。2.2.2 平台设定及定标平台一般放置在第三象限 (SW) , 位置尽量远离池壁边缘, 避免鼠环绕池壁游泳触及, 导致非记忆性上台。大鼠游动致水面波动常使平台移动, 平台移位可致大鼠上台却无法自动停止数据采集, 所以注意保持平台位置固定。目标区域定标要用和鼠颜色相近物体定标, 定标物应将整个平台覆盖, 否则也会出现鼠上台数据采集无法停止, 从而影响实验数据的准确性。2.2.3 实验动物选择不是所有鼠都适合水迷宫实验, 小
11、鼠中 KM、SAM 小鼠由于基因库大, 杂交率高, 个体差异大, 存在不上台或引导上台后再次入水的情况。近交系 BALB/C 小鼠几乎不能学会游泳, 因而不能用于水迷宫, ICR 小鼠、SD 大鼠和 Wistar 大鼠是常用于水迷宫的实验动物, 而且雄性多于雌性。此外, 一次实验动物的性别、体重、品系、周龄等应保持一致, 以减少数据的偏差。2.2.4 控制实验应激控制实验条件的一致性即可有效控制实验应激。在动物体重、品系、周龄等一致的前提下, 保持水池温度均一, 建立实验操作人员和动物的熟识度, 保持实验室环境及其物品陈设不变, 可有效控制实验动物的应激。保持安静的实验环境, 保持操作人员的体
12、味不变也需要关注。对于需要实验前给药, 建议给药操作和水迷宫操作者一致, 这样也可以很好地建立实验操作者和动物的熟识度, 减轻操作引起的应激。悬尾可显著影响鼠的空间学习及记忆能力, 从水中取鼠操作中, 悬尾还可能导致水抢入呼吸道引起应激。实验中要避免鼠的悬尾状态。2.2.5 其他实验中光线要保持均匀可以消除伪迹, 见图 1。新型的水迷宫设备水池四周装一黑色、浅蓝色或者白色的遮光帘, 这样即可以将光的影子挡住, 又可以减少外界空间参照物不确定性对实验结果产生的影响。水迷宫实验对衰老引起的记忆减弱敏感, 但用老年鼠进行实验时, 应确认衰老鼠的游泳能力降低不影响实验结果。3 实验数据及统计处理Mor
13、ris 水迷宫实验的数据众多, 如何选择有意义的指标作为评价动物学习记忆水平变化的依据, 是实验获得正确可靠结论的前提。选择恰当的统计方法对数据进行处理则为实验结论的获得提供佐证。3.1 水迷宫实验指标及意义Morris 水迷宫实验的指标包括:持续时间 (潜伏期) 、总路程、平均速度、四个象限的时间和路程、初始角、外环区域路程、中环区域路程、中心区域路程、第一次穿越平台时间及穿越次数、搜索策略等。每个指标的意义各不相同。3.1.1 潜伏期和总路程潜伏期是 Morris 水迷宫定位航行阶段的重要指标, 是动物每一次入水后第一次成功找到平台所需的时间。它的长短也代表着动物空间学习记忆能力的好坏,
14、潜伏期短, 预示着动物的学习记忆能力好。潜伏期和动物游泳速度也有关, 若正常大鼠游泳速度慢, 潜伏期会比痴呆组动物长而影响结果。某些动物放入水中后会左右观望打圈, 或者原地不动确定方向后直接游到台上, 观察到这种现象, 说明动物记忆力好, 也有动物原地不动致潜伏期延长, 因此, 实验中应注意观察动物的游泳状态, 以便综合判定实验数据。潜伏期也是空间搜索实验的第一次跨越平台时间。总路程是动物第一次上台前总的运行路程, 和潜伏期同样是重要的评价指标。可单独应用或以平台象限路程/总路程作为评价动物学习记忆的指标。3.1.2 四个象限时间和路程平台所在象限的时间和路程是评价动物学习能力的指标, 动物在
15、这个象限活动的时间和路程越长, 反映了动物的空间记忆能力比较好。平台象限时间/潜伏期或平台象限时间/第一次跨越平台时间、平台象限路程/总路程也是较好的评价动物学习记忆的指标。其他仅作为参考。3.1.3 外环区、中环区、中心区路程啮齿类动物游泳有绕边性或边缘性, 站台远离周边靠近水池中心, 如果动物改变了游泳路线, 在水池中心区域内活动的路程长的话, 反映其空间记忆能力好, 反之则说明空间记忆力差。有些系统则同时给出不同区的时间和路程, 各区时间和路程与总时间或总路程的比值可作为定位航行和空间搜索阶段的共同指标。3.1.4 穿越平台次数是空间搜索实验的重要指标, 即在撤去平台后, 在一定的时间内
16、, 实验动物穿越原站台位置的次数。动物穿越原站台位置的次数越多, 说明其空间学习记忆能力越好。平台较小或者水池较大的时候, 计算机有时亦会发生漏计的情况, 因此实验中也要注意观察。3.1.5 初始角-弧度指在将实验动物放入水池后, 动物的运动轨迹的起始点的切线与起始点和站台中心连线之间的夹角;如果初始角的角度越小, 说明动物记得站台的位置, 直接向站台方向游, 反映空间学习记忆能力比较好。但该指标和学习记忆的相关度较弱3。3.1.6 搜索策略大鼠寻找平台的方式大致可分为四种:边缘式、随机式、趋向式及直线式, 见图2。不同的搜索方式代表大鼠以不同的策略寻找平台, 正常动物的搜索策略随着训练次数的
17、增加而呈现“边缘式随机式趋向式直线式”的变化规律。痴呆动物的搜索策略会发生异常变化。比如只有边缘式随机式, 或者随机式边缘式, 趋向式和直线式比较少见。图 2 不同 Morris 水迷宫搜索策略 下载原图3.2 实验数据的统计处理Morris 水迷宫实验的指标众多, 目前国内采用最多的是定位航行实验的潜伏期、总路程和空间探索实验的穿越平台次数、平台象限路程/总路程、平台象限时间/总时间9。有资料显示平台象限路程/总路程、原平台象限时间/总时间、总路程更可靠3。有研究者认为每天第一次入水的结果更能显示组间差异10, 或者以训练后几天数据的平均数进行统计。基于相关研究, 我们认为对于获得性训练阶段
18、的数据, 我们可以计算每只动物经过一段时间学习后某一天或几天数据均数, 甚至可以计算每只鼠学习阶段的全部数据的均数, 然后进行组间比较, 这样要比单独某一次的数据更能反映动物总体学习情况和学习成绩。关于统计方法, 闫盼盼等11认为 Morris 水迷宫实验属重复测量设计, 获得的数据受动物组别、检测时间点等多个效应因子影响, 同一受试动物不同时间点所测得的数据存在高度的自相关性, 且存在截尾数据 (最大潜伏期) 。因此, 对 Morris 水迷宫中各种数据应采用重复测量数据的多因素方差分析结合截尾数据的生存分析方法较为恰当5。我们的认为, Morris 水迷宫获得的数据虽然属于重复测量数据,
19、涵盖时间、处理因素以及处理因素和时间的交互效应的影响, 但在实验设计和操作中进行组间非处理因素的均衡, 当分析目的仅针对结局或某个时间点的组间效应比较时, 而不是考虑不同组间的时间点连续变化趋势差异, 可以对点数据 (某天或某次) 或者学习阶段每只鼠全程数据平均值 (作为最终学习成绩) , 进行组间单因素方差分析比较, 和采用重复测量数据的多因素方差分析得出的结论一致。4 小结目前国内 Morris 水迷宫实验方法的差异和不确定可能造成某些实验结果失真, 使实验质量和实验效率降低。定位航行和空间搜索两个阶段是 Morris 水迷宫的经典方法, 应严格遵循操作程序及注意事项。附加实验一般难度增加
20、, 是否进行取决于实验目的, 难度增加的任务对动物轻微认知障碍的检测更为敏感。需要更精确检测动物认知功能时可以选择。实验动物经过一段时间的学习后, 其学习成绩会稳定在某一水平, 因此, 学习的时间延长不会提高实验质量和效率, 反而会加重实验负担。关于指标选择上更多建议多个指标联合使用, 以免指标过于单一造成实验偏差。而一份好的实验数据对统计方法的要求非常简单, 一种适宜统计方法都可以描述其特征的变化规律。无论采用什么统计方法、选取哪次实验的数据, 控制好影响动物游泳状态的相关注意事项, 获得稳定可靠的实验数据是获得正确结论的基础。统计处理方法不会影响实验的结论。参考文献1 Morris RGM
21、.Spatial localization does not depend on presence of local cuesJ.Learning Motivation, 1981;12:239-60. 2封敏, 卢圣锋, 张承舜, 等.国内大鼠 Morris 水迷宫实验现状与分析J.辽宁中医杂, 2011;38 (11) :2170-2. 3 Vorhees CV, Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memoryJ.Nature Pr
22、otocols, 2006;1 (2) :848-58. 4薛丹, 徐淑萍, 刘进修, 等.水迷宫实验中三种品系小鼠学习记忆能力的比较J.中国实验动物学报, 2010;18 (2) :149-52. 5胡镜清, 温泽淮, 赖世隆.Morris 水迷宫检测的记忆属性与方法学初探J.广州中医药大学学, 2000;17 (2) :117-89. 6陈娟, 左红艳, 王德文, 等.不同波段电磁辐射对大鼠学习记忆的影响J.中医行为医学科学, 2006;15 (12) :1061-3. 7何平, 王爱国, 夏涛, 等.PBDE-47 单独和与 PCB153 联合染毒对大鼠神经发育的影响J.环境与健康杂志,
23、 2008;25 (9) :763-6. 8王瑞婷, 申兴斌, 左彦珍.黄芩茎叶总黄酮对 AD 模型大鼠学习记忆能力及神经元损伤的影响J.山东医药, 2008;48 (44) :30-1. 9陈罗西, 郭玲玲, 李亮.Morris 圆形水迷宫的应用及其相关检测指标分析析J.辽宁中医药大学学报, 2008;10 (8) :55-7. 10罗小泉, 骆利平, 陈海芳, 等.Morris 水迷宫检测大鼠记忆力方法的探讨时珍J.国医国药, 2010;21 (10) :2667-9. 11闫盼盼, 闫国利, 詹向红, 等.Morris 水迷宫检实验设计的统计学方法探析J.中国中医药学刊, 2013;31 (2) :264-6.
