1、细胞污染的类型及其预防措施,生产部刘彩云,细胞污染的类型及其预防措施,1. 细胞污染概念2. 细胞污染分类3. 污染的鉴别4. 细胞污染的预防5. 影响细胞生长的其他因素6. 污染的可能原因7. 污染的清除,一、什么是细胞污染？,凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。,二、细胞污染的类型及状态,物理污染,2.1 细菌污染,细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以
2、白色葡萄球菌较常见。,黑色细沙状，高倍镜下呈圆球状颗粒，做布朗运动；细胞内颗粒增多、变粗；培养基浑浊变黄，pH改变。对细胞生长影响明显。,细菌污染,2.2 真菌污染,真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。,霉菌污染,真菌污染：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，慢慢的会长出很细的黑色丝状物真菌生长的比较慢。,2.3 支原体污染,支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除它，光镜
3、下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。,支原体内的DNA被荧光染料着色,培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。,2.4 原虫污染,培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以 生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。,螨虫污染,2.5 黑胶虫污染,黑蛟虫：直径小于0.1m，可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下
4、为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。,黑蛟虫污染,2.6 病毒污染,组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。,人角膜上皮细胞被HSV-1感染后的形态学变化,由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。病毒污染难于发现，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，但它可能会影响实验的结果。,2.7 细胞交叉污染,细胞污染是由于在培养过
5、程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。有些变化轻微，不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制，最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。,三、污染的鉴别,1、细菌、真菌污染的检测 （1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。 （2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树
6、枝状或卵形的物质常为真菌污染。,四、细胞污染的预防,污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。 一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。 只有将预防措施贯穿于整个细胞培养的始终，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：,4.1 消毒,制备间 0.1% 新洁尔灭、75%酒精、紫外照 射、臭氧熏物料耗材 高压灭菌、75%酒精、紫外照射、臭氧熏,4.2 无菌操作,整个操作过程要迅速敏捷但不能过快，以免形成气流。工作台内放置的所有培养瓶瓶口不能与与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口。
7、吸取培养液、DPBS或其它试剂是注意换管，防止交叉污染或污染扩大。使用培养液前，不宜较早开启瓶口。开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封口。培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中。操作时不要交谈、咳嗽，以防止唾沫和呼出气流引发污染。,4.2 无菌操作,操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭工作台。在培养室中观察细胞也要有无菌观念，在搬动培养皿时动作要轻巧，不要猛烈震荡，不要接触瓶口区域以防污染。每次观察时间不能太长，以免温度过低影响细胞生长。每次观察时不要把细胞全部取出，要分次分批进行，尽可能减少细胞在外暴露时间。,五、影响细胞生长的
8、其他因素,温度过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱 中取出的培养液直接加至37培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响实验现象的观察辐射对紫外线敏感的试剂不能放在紫外线下灭菌，同时对见光易分解的物质进行避光处理放射线试剂周围不能放同位素振动细菌内毒素它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热）。,六、污染的可能原因,污染的可能原因：可能原因很多。比如配液消毒问题、操作问题、环境
9、问题等等。关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。（1）孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水（2）超净台取材器材培养液培养瓶操作等因素（3）超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染（4）无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。,七、污染的清除,培养细胞一经污染，多
10、数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。,七、污染的清除,1、细菌和真菌的清除 使用抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量510倍的冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。 两性霉素B是一种对真菌有抗菌活性的抗生素。将其作为一种抗真菌、抗酵母菌以及抗霉菌制剂使用。它通过与固醇结合，干扰敏感真菌的细胞膜渗透性。通常的有效浓度是2.5g/ml，在30g/ml时有细胞毒性。真菌污染是个很麻烦的事，很难彻底消除，建议重新复苏细胞或从新分离或购买细胞。用MRA处理 。2、支原体的清除 用MRA（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康。,
