1、第5章 细胞融合与单克隆抗体Cell Fusion and Monoclonal Antibodies,细 胞 融 合细胞工程的诞生,融合细胞的制备,诱导细胞融合的主要方法,病毒诱导融合2. 化学融合剂诱导融合常用的是脂质体、聚已二醇（PEG） 3. 电融合,病毒诱导融合,脂质体诱导融合,电融合（视频）,是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。,5.1 单克隆抗体技术,1984年诺贝尔奖,Monoclonal Antibody ：McAbDefinition:,Mono: OneClone: A strain of cells
2、descended form a single cellAntibody: A molecule of animal origin that has immunolgical activity only against the antigen to which it was made,5.1.1 单克隆抗体技术的原理,单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的与单一抗原决定簇结合的抗体。,Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58,1
3、,2,3,4,1,2,3,4,单克隆抗体,细胞融合,取出脾细胞,+骨髓瘤细胞,x,传统抗血清（多克隆抗体）,抗原,免疫,1,2,3,4,B细胞,抗原免疫小鼠後，其脾臟會產生分泌抗體的各種 B 細胞。,每種 B 細胞只能分泌一種抗體，對抗各自的抗原決定基。傳統抗血清便是所有抗體的混合，得以有效保護動物個體。,假如能够把单一 B 细胞挑出来培养，则可收获单抗。但是，B 细胞无法常规培养。,癌細胞可以在試管中持續培養生長，但無法產生所要的抗體。,这些单独的融合细胞可以大量生产单一种抗体，即单克隆抗体。,若把 B 细胞与癌细胞融合，所得到的融合细胞可分别培养。,制备过程：视频,自己绘图,Immuniz
4、e the mice - Housing,Immunize the mice - Inoculation,How Lymphocytes Produce Antibody,Test the serum - Bleeding the mice,Blood is drawn into the tube.,A capillary tube is applied to nicked vein.,Test the serum - In the Lab/ ELISA,Perform a fusion - Growing the cells (hybridomas),Fusions are performe
5、d in a Biosafety Cabinet.,Cells are grown in 96-well plates.,Grow the hybridomas,Concentrate and Purify the Product,5.2 人源性单克隆抗体的制备,多克隆抗体鼠源单克隆抗体人-鼠嵌合抗体人源化抗体全人源抗体,轻链,重链,免疫球蛋白的基本结构,四条链对称结构,鼠源单抗临床应用的障碍,血清半衰期短，20h抗原抗体结合力、亲和力不够募集效应细胞产生副作用HAMA反应：810天出现，2030天高峰, 加速单抗清除。过敏休克,HAMA反应Human Anti-Mouse Antibodie
6、s,鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体，叫做人抗鼠抗体（HAMA）反应。HAMA反应对鼠源的单抗分子有着较强的破坏作用，严重影响了鼠源单抗在人体内的功效，所以非常有必要改进鼠源单抗。,5.2 人源性单克隆抗体的制备,5.2.1 EB 病毒转化技术5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术1 人-鼠杂交瘤单克隆抗体2 人-人杂交瘤单克隆抗体3 EB 病毒转化-融合技术4 转基因动物制备单克隆抗体5 重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体5.2.3 人单抗制备技术的发展（新基因工程技术） 嵌合抗体、改型抗体、抗体库,5.2.1 EB 病毒转化技术,EB病毒（
7、epstein-barr virus,EBv）是epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名。EB病毒的形态与其他疱疹病毒相似 。EB病毒仅能在B淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代。,EB病毒转化淋巴细胞,5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术,1 人-鼠杂交瘤单克隆抗体人脾细胞鼠骨髓瘤细胞,5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术2 人-人杂交瘤单克隆抗体,人脾细胞人骨髓瘤细胞细胞种类少,5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术3 EB 病毒转化-融合技术,利用EB病毒转化B淋巴细胞为永生细胞 与
8、鼠骨髓瘤细胞融合,5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术4 转基因动物制备单克隆抗体,人抗体基因(除CDR)导入小鼠胚胎转基因小鼠抗原免疫标准杂交瘤方法,转入人的Ig基因组,免疫动物,人抗体,基因敲除小鼠,将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术5 重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体,SCID: severe combined immunodeficiency mouse 既无有功能的T细胞也无B细胞的小鼠,对异源移植物不产生任何排斥反应,可以作为良好的载体系统用于医学及生物学各个领域的研究,但极易感染病菌
9、,饲养和操作管理十分复杂。,SCID,将人淋巴细胞移植到体内,重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体,将人淋巴细胞移植到小鼠体内抗原免疫标准杂交瘤方法或制备抗体库,裸 鼠,T淋巴细胞功能缺陷1962年偶然发现有个别无毛小鼠， 后来证实是由于基因突变造成的并伴有先天性胸腺发育不良，称为裸小鼠(nude mice)，用“nu”表示裸基因符号。裸小鼠是由于染色体上等位基因(第11对染色体上)突变引起的，已失去正常胸腺。,特 性,裸小鼠的主要特征表现为无毛(hair less)和无胸腺(athymus)。随着鼠龄增加皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。由于无胸腺,仅有胸腺残迹或异常上皮,这种上皮不能使T细胞
10、正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴细胞正常，但功能欠正常,饲 养,5.2.3 人单抗制备技术的发展（基因工程）,人-鼠嵌合抗体改型抗体组合抗体库技术与噬菌体抗体文库技术表位印模选择技术,CDR移植互补决定区 complementarity determining regions,小 结,人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。,利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列制备的人源化抗体称为：,A:
11、人-鼠嵌合抗体B: 改型抗体 C: 组合抗体D: 表位印模选择抗体,5.3 单克隆抗体在医学上的应用,（一）用作诊断试剂 1. 检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2. 鉴定病原体，准确诊断传染病。 3. 用于肿瘤的诊断和分型。 4. 激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态。,（二）用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子的功能（三）用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗,生物导弹,“生物导弹”单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免
12、化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。,New approaches: Theres hope for the future.,单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应,总投资约65亿元的浙江特瑞斯药业股份有限公司成为湖州开发区利用国家级政策优势审批成立的首家中外合资股份制有限公司,2011年11月8日，中外合资浙江特瑞思药业股份有限公司取得外商投资企业批准证书，这是湖州国家级经济技术开发区利用外资审批权下放的政策优势，审批的首家外商投资的股份制
13、有限公司。中外合资特瑞思药业股份有限公司，中方由济和集团有限公司发起，联合杭州英瑞实业投资公司、浙江正联投资公司，美方由留美生物医药创新团队领军人物吴幼玲博士、美国创兴生物制药有限责任公司合作共同建立，是一家主要从事生物创新药和生物类似药的研发生产及销售的中外合资企业。,项目选址于湖州市南太湖生物医药产业园内，计划总投资约65亿元，建设周期为2010年2022年，将分六个阶段建设3条符合cGMP标准的抗体药物生产车间，打造国际性的治疗用单克隆抗体研发生产基地，最终把公司建设成“国内领先，国际一流”的生物医药龙头企业。其中，首期项目将在三年内建成国内首条自主建设的符合cGMP标准的抗体药物生产车间，启动国内自主研发的首个治疗性单克隆抗体药物的批量生产，进而将彻底改变我国对此类药物全部依赖进口的状况，对我市打造长三角地区著名的生物医药基地，加快经济转型升级具有重大的推动作用。,1) 简介鼠源性单克隆抗体制备的原理，并绘图说明其操作流程2) 简介单克隆抗体的应用3) 为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人源化，改造的方法有那些？4)请自己查阅资料，简介单克隆抗体最新研究进展,思考题,Monoclonal Antibodysevere combined immunodeficiency mouse,谢 谢!,下节课:胚胎工程,
