1、第九章 反义核酸,反义核酸技术（antisense nucleic acid technology）是根据核酸杂交原理设计的以选择性地抑制特定基因表达为目的的一类核酸研究新技术，它包括反义RNA（antisense RNA,asRNA）、反义DNA（antisense DNA,asDNA）及核酶（ribozyme,RZ）三大技术领域。,该技术不仅对于从反向遗传学的角度研究特定基因的功能及RNA的剪切、加工和转录、翻译调控等具有重要理论意义，而且对于开发作用于基因水平上的高度特异性新型抗病毒和抗肿瘤药物等具有重要的实用价值。,一 反义RNA,20多年前，首先在原核细胞中发现一种通过与mRNA互补
2、形成双链结构而调节基因表达的RNA分子，称之为asRNA。真核细胞中也具有asRNA，但功能不十分清楚。 近期研究表明：人工合成asRNA的基因并将其导入细胞内，转录出asRNA，则能阻断该基因的表达。这有助于从反向遗传学的角度了解基因对细胞生长和分化的影响。同时也表明用该法对肿瘤等基因病实施基因治疗提供了可能。,按asRNA的作用机制，可将其分为三大类：,1 类：直接作用于靶mRNA的SD序列和编码区。 SD序列（shine-dalgarno,SD）：起始密码子AUG和其上游3-11个核苷酸处一段3-9个核苷酸序列，是16SrRNA结合的位点。 A类：作用后直接抑制其翻译。 B类：与靶mRN
3、A结合后，引起双链RNA分子对RNA酶的敏感性增加，使其降解。,2 类：与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。 3 类：直接抑制靶mRNA的转录。,（二）asRNA的制备方法：与一般基因克隆方法类似。 1 as-cDNA的制备。 2 asRNA表达载体的构建。 3 asRNA表达载体向细胞内的导入。,（三）asRNA的应用：,目前在植物学领域和抗肿瘤与抗病毒方面研究较多，主要有：通过抑制植物特定花色素酶的活性而改变植物开花的颜色。通过抑制导致水果腐烂的酶而延长水果的保存期。用asRNA治疗某些基因病。用于动物的抗病育肿。用于肿瘤和病毒病的治疗。,二 反义DNA：
4、,指一段能与特定基因结合并抑制其表达的合成寡核苷酸，其长度一般为20bp左右，也称反义寡核苷酸（antisense aligodeodexynucleotide, ASON/ASODN）, 其理论基础是碱基配对，因此，可以设计任何感兴趣基因的ASON。,理论上一个15bp长的寡核苷酸只能特异性地结合整个人类基因组中的一个基因。由此可见，ASON是极具潜力的基因功能阻断剂，对与致病基因有关的疾病的治疗极具重要意义。会成为新一代基因治疗的药物。,三 核酶（ribozyme）,是具有催化活性的RNA，它们大部分参与RNA的加工和后熟。 背景1982年Cech发现四膜虫rRNA前体自我剪接作用，RNA
5、有催化作用;1983年发现RNase P中的RNA可催化tRNA前体的加工。例:四膜虫rRNA前体剪接过程: 1.二次剪接以磷酸酯转移形式，需鸟苷作辅助因子。2 .内含子自身环化时剪切核苷酸。,核酶的结构与作用,1. 核酶的锤头结构:科学家Symons自多种植物病毒卫星RNA及类病毒RNA的自我剪接研究中，观察到自我切割区内有锤头结构（hammer-head structure），其中的结构特点是：（1）三个茎区形成局部的双链结构；其中含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。（2）图中的箭头表示自我切割位点，位于GUX的X外侧，X可表示为C、U或A，不能是G。,2. 核酶的作用（1）核苷酸转移
6、作用。（2）水解反应，即磷酸二酯酶作用。（3）磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。（4）脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。（5）RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。,核酶的生物学意义,1. RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。2.打破了酶是蛋白质的传统观念。3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。,核酶与内含子的关系,1.目前发现的核酶数量较少，常见于rRNA的内含子。2.内含子存在于各种RNA分子中，它们并不都具有核酶的功能。3.内含子分为三类：（1）内含子可自我剪接,不需任何蛋白质参与,通常分两型-需鸟苷参与。形成套索形式剪接。（2）内含
7、子的剪接需要蛋白酶的参与，如tRNA。（3）内含子的剪接需形成剪接体的形式，除各种蛋白因子外还需各种snRNP的参与。,四、RNA干涉,RNA interference or RNAi: 指用双链RNA去抑制特定mRNA的翻译而使该基因编码的蛋白不被表达, 从而使研究物种出现一定的表征(phenotype). 一般包括构建所研究基因片段的同向重复(中间用细菌内含子或报告基因(gus, gfp)连接)的载体, 再转入生物体内.,一些长度较短的核糖核酸、即所谓siRNA(smallinterferenceRNA)，能够对细胞和基因的很多行为进行控制，比如打开和关闭多种基因，删除一些不需要的DNA片
8、段等。它们在细胞分裂过程中更是发挥了至关重要的控制作用，对引诱细胞形成某种特定类型的组织产生深远的影响。科学把这一令人激动的发现当作2002年最重大的科学突破来欢呼，这些发现将使生物学家们重新审度细胞及其演化过程。,一系列发现表明这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。,研究历史与发展前景,双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNAinterference,RNAi）双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA
9、)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。,RNAi现象早在1993年就有报道：将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。,1995年，康奈尔大学的SuGuo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（antisenseRNA和正义RNA（senseRNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，AndrewFire的研究证明，在正义RNA阻断了
10、基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。,作用机理,目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。,双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶，RNA-directedRNApolymer
11、ase）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解 。,另一方面结合的产物以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双
12、链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。,siRNA还能够通过某种不太明了的机制永久地关闭或者删除DNA片断，以在非常大的程度上控制染色质的形成，而不是仅仅暂时地抑制它们的活动。动植物和人体的病原体中有一些是RNA病毒，如导致艾滋病的HIV和SARS的冠状病毒都是RNA病毒。有些RNA病毒在复制过程的一定阶段中会产生双链RNA。如果宿主体内有分解这种双链RNA的酶，就可将双链RNA切割成许多小的片段，这种小片段会与病毒RNA基因组的同源部分结合，使病毒基因失去复制功能，也就不能危害宿主。所以RNAi是自然界生物长期进化形成的一种防御机制。,RNAi技
13、术,Dicer,RNAi技术,siRNA,5,3,5,3,Initiation Step,Initiation Step,RISC,2 RNA binding proteinsRNA/DNA HelicaseTranslation Initiation FactorRNA-Dependent RNA Polymerase (RdRP)Transmembrane Protein,Initiation Step,ATP,ATP,ADP + ppi,ADP + ppi,DICER,KINASE,RdRP,Effector Step,siRNA bindingsiRNA unwindingRISC a
14、ctivation,RNAi技术,Vectors expressing siRNAs,U6,H1,siRNA,Vectors expressing siRNAs,U6,Sense sequence,Anti-sense sequence,Hair-pin loop,RNAi的应用,1、功能基因组的研究 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。RNAi技术高效、特异、低毒性、周期短、操作简单等优势是传统的基因敲除技术
15、和反义技术所无法比拟的。,2.基础研究领域 例如在信号传递途径中，根据RNAi产生的功能丧失表型，可以很容易的从某一信号传递途径被打断的所有表型中鉴定出被降解的mRNA，从而鉴定出参与了信号传递通路的信号分子。还有可能通过打靶某一信号分子mRNA明辨其与其它信号分子在传递通路中的关系。在发育研究中，已经发现许多miRNA可能参与其中的基因调节，例如在线虫中，let-7和lin-4对幼虫发育起着关键作用；而在拟南芥中，miR-172参与花发育的调节。这提示RNAi现象可能对发育也是极其重要的。,3、疾病治疗 一方面，RNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。例如在抗肿
16、瘤治疗中，RNAi可用于抑制癌基因的表达；或者利用RNAi 的高度特异性敲除点突变激活的癌基因；也可用于抑制基因扩增或抑制融合基因表达；还可用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因（如血管内皮生长因子VEGF或多药耐药基因MDR）的表达。,在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的siRNA来抗病毒，目前针对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒（influenza virus）、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）、HIV-1、SARS等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用。但是由于目前基因治疗普遍存在的缺
17、少高效低毒的转运载体，限制了RNAi在体内的应用。,另一方面，目前更可能实现的是利用RNAi确定新的疾病相关基因，尤其是建立高通量的RNAi功能分析方法可以为下一步的药物筛选提供更多的可能靶蛋白；并可以利用RNAi来确认许多疾病的发生发展机制，为其治疗提供依据。,4、 在植物中的应用 RNAi的功能之一是保护基因组不被可移动的基因元件如转座子或病毒RNA的侵犯， RNAi效应在植物及线虫中还具有transitive和spreading现象，因而为植物中利用siRNA抗病毒提供了广阔的前景。根据RNAi的随机降解的PCR模式机制下，21nt大小的片段足可以在RdRp作用下产生对靶mRNA其它序列
18、沉默表达作用。这种以靶mRNA为模板的PCR模式尤其适用于抗变异病毒：只需要根据病毒保守的序列设计siRNA，就可抑制所有的变异病毒。,用siRNA沉默基因,RNAi在基础研究领域和医学研究领域的应用，其基础是siRNA的基因沉默作用。目前在体内或体外RNAi中应用的siRNA主要有两类：RNA和DNA载体。1、 RNA（1）siRNA：化学合成或体外转录的方法得到21nt的两段小RNA，经退火后形成19个碱基互补，两边3 端各有2个碱基突出的siRNA。目前此类siRNA应用最广泛。尤其是经过修饰后提高稳定性的siRNA仍可表现特异的基因沉默作用，为其在体内的应用提供了可能的前景。,（2）e
19、siRNA：因为上述的siRNA基因抑制的有效性关键在于靶基因序列片段的选择，但现在并不知道mRNA的哪一个部位对siRNA更敏感，所以根据靶基因mRNA设计的长dsRNA经Dicer剪切成一系列21nt的siRNA统称为esiRNA，可能更有效、更方便的抑制基因的表达。（3）发夹RNA：根据miRNA设计的发夹RNA，或基于siRNA的发夹RNA在体内都表现出有效地基因抑制作用。,2、DNA载体由于在哺乳动物和果蝇中不存在RNAi的扩增机制，导入以上RNA产生的RNAi作用不可避免的具有瞬时性。为了克服这个弱点，一些研究小组发展了基于DNA载体在体内表达siRNA的技术。这种载体可以是质粒，
20、也可以是病毒，甚至可以是DNA片段。（1）基于RNA聚合酶II启动子的表达系统：在弱或无干扰素应答反应的组织或细胞中，可以构建长的发夹RNA，进一步由Dicer剪切成siRNA。这种表达系统的优点是允许组织或细胞特异性的dsRNA表达，但是绝大部分哺乳动物细胞对长的发夹RNA的干扰素应答而产生非特异作用，限制了此类表达系统的广泛应用。,（2）基于RNA聚合酶III启动子的表达系统：目前主要应用的是U6启动子和H1启动子，一方面它们在体内有较高的转录效率，另一方面以数个连续T为终止信号，限制了RNA的大小从而不引起干扰素的非特异作用。此种表达系统还可分成三类：一是基于发夹RNA的基因沉默效应而设
21、计的表达发夹RNA的质粒载体；二是在载体上构建两个启动子分别表达siRNA的正义RNA和反义RNA；三是共同导入分别表达siRNA的互补片段的含有U6或H1启动子的DNA片段，或者表达发夹RNA的DNA片段。尤其是后者，可以用PCR方法方便的获得，大大扩展了其应用。,问题在siRNA与RNAi的研究中，仍有许多的问题：蛋白是如何与siRNA组合在一起的，如何成为活性形式？对靶RNA的剪切作用，其相关的分子机制如何，是需要特异的蛋白来剪切靶RNA，还是引导的siRNA本身即有剪切作用等。哺乳动物与人的RNAi机制是否与简单的真核生物类似，RNAi的进化地位如何等。,猜想1、疾病治疗：主要的问题还
22、是转运系统的选择，如何找到一种高效而低毒的用于人体的转运载体是摆在所有RNAi应用面前的最大敌人。依靠免疫系统寻找转运载体可能成为途径之一，而免疫系统中本身可能也有RNAi参与。细胞中是否普遍存在RNAi或进行RNAi的潜力呢？细胞的凋亡机制可能也与RNAi有关。病毒的蛋白质复制途径可能有多种，RNAi是否能像人们期待的那么有效？,2、如果siRNA可以永久地关闭或者删除DNA片断，而不仅仅是短期的抑制它。那么动物细胞全能性受抑制的程度可能远远高于过去人们所想象的。干细胞的可塑性可能是由于可以产生特异的siRNA或其前体。干细胞通过细胞内的RNAi机制在发育过程中关闭或开放基因的表达，从而指导着细胞的定向分化。其中的siRNA有可能来自DNA的内含子。 RNA干涉,
