刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化.doc

1、刚地弓形虫肌动蛋白 profilin 的原核表达和纯化 李会敏 伊焕发 吉林大学第一医院转化医学研究院移植免疫实验室 吉林大学第二医院检验科 摘 要： 目的:探讨刚地弓形虫肌动蛋白 profilin (TgPRF) 的原核表达体系和纯化条件, 为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法:以弓形虫 RH 株速殖子的 cDNA 为模板, 采用一对特定的引物扩增 TgPRF 基因的编码区。PCR 产物双酶切后克隆入 pET28a (+) 载体中。重组的 pET28a (+) -TgPRF 质粒转化 E.coli DH5 感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆, 并选取测序正确的质粒转化 E.coli BL21

2、 (DE3) 表达菌, 经 IPTG 诱导表达 4 h, SDS-PAGE 法检测 TgPRF 蛋白的表达, Western blotting 法检测重组蛋白 His-prolilin 的表达。结果:PCR 扩增产物长度为 492bp。经双酶切和测序, 重组质粒 pET28a-TgPRF 连接产物构建成功。SDSPAGE 检测, 目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经 Ni-NTA 琼脂糖凝胶柱纯化, 获得纯化的 TgPRF 蛋白 (纯度90%) 。Western blotting 检测, 重组TgPRF 蛋白能被 Anti-His 抗体识别。结论:成功构建重组质粒 pET28a-TgPRF, 并

3、实现可溶性原核表达。关键词： 刚地弓形虫; profilin; 原核表达; 蛋白纯化; 作者简介：李会敏 (1983-) , 女, 吉林省长春市人, 在读医学博士, 主要从事免疫耐受与免疫调节方面的研究。作者简介：伊焕发, 教授, 博士研究生导师 (Tel:0431-88783042, E-mail:) 收稿日期：2017-03-21基金：吉林省科技厅自然科学基金资助课题 (20150101127JC) Prokaryotic expression and purification of Toxoplasma gondii profilin proteinLI Huimin YI Huanfa

4、 Department of Transplant Immunology Laboratory, Institute of Translational Medicine, First Hospital, Jilin University; Abstract： Objective:To discuss the prokaryotic expression system and purification conditions of Toxoplasma gondii profilin-like protein (TgPRF) , and to provide basis for the study

5、 on anti-tumor immuno-adjuvant.Methods:The coding region of TgPRF gene was amplified with a pair of specific primers which were designed according to the cDNA of tachyzoites of Toxoplasma gondii RH strain.The PCR products were cloned into the pET-28 a (+) vector after double enzyme digestion.The rec

6、ombinant pET28 a (+) -TgPRF plasmid was transformed into E.coli DH5cells.The positive clones were selected by the double restrictive enzyme digestion and sequencing.The correct pET28 a (+) -TgPRF plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced for 4 h by IPTG.The expression of recombinant

7、 TgPRF protein was analyzed by SDS-PAGE method;the expression of recombinant protein His-profilin was detected by Western blotting method.Results:The length of product of PCR was 492 bp.The recombinant plasmid pET28 a-TgPRF was confirmed by double restriction enzyme digestion and sequencing.The SDS-

8、PAGE results showed that the target protein was expressed in E.coli BL21 (DE3) in bacteria supernatant.The purified TgPRF protein was obtained by Ni-NTA agarose gel column chromatography with the purity90%.The Western blotting results revealed that the recombinant TgPRF protein could be recognized b

9、y Anti-His antibody.Conclusion:The recombinant plasmid pET28 a-TgPRF is successfully constructed, and the TgPRF protein is obtained with the soluble prokaryotic expression.Keyword： Toxoplasma gondii; profilin; prokaryotic expression; protein purification; Received： 2017-03-21弓形虫是一种专性细胞内寄生的病原体, 具有广泛的

10、宿主范围;可感染人和多种动物, 引起人兽共患病1。弓形虫感染主要分为急性和慢性 2 个阶段, 大多数弓形虫感染的人或动物表现出强烈的细胞介导的免疫反应。宿主通过自然杀伤 (natural killer, NK) 细胞和 T 细胞产生的干扰素 (interferon gamma, IFN-) 参与宿主抵抗2-5。刚地弓形虫肌动蛋白 profilin (Toxoplasms gondii profilin protein, TgPRF) 是弓形虫入侵机体的一个必需蛋白分子, 与其他蛋白聚合形成滑行体, 从而有效地穿越机体的生物屏障并进一步入侵宿主细胞。因此破坏 TgPRF 可阻断弓形虫的滑行运动6

11、-7。TgPRF 在小鼠的巨噬细胞和树突状细胞 (dendritic cells, DCs) 中可识别 Toll 样受体 11 (Toll-like receptor 11, TLR11) 和 12, 在人类抗体中可识别 Toll 样受体 5 (Toll-like receptor 5, TLR5) , 调控 DCs 分泌白细胞介素 12 (interleukin12, IL-12) 和干扰素 (interferon alpha, IFN-) 及 NK 细胞分泌的 IFN-因子, 因此 profilin 蛋白被认为与抗弓形虫免疫有关8-10。CpG 岛 (Toll 样受体 9 的配体) 和单磷

12、酰脂质 A (monophosphoryl lipid A, MPL, 即 Toll 样受体 4 的配体) 等 Toll 样受体的配体作为抗肿瘤佐剂已经进入临床前实验, 但 TgPRF 作为免疫佐剂的研究尚处于起步阶段11-13。为进一步研究 TgPRF 作为免疫佐剂的作用及其相关的抗肿瘤免疫机制, 本实验成功构建了重组质粒 pET28aTgPRF 并实现了 TgPRF 的可溶性原核表达, 为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究奠定了基础。1 材料与方法1.1 弓形虫 cDNA、质粒和菌种cDNA 来源于刚地弓形虫 RH 株。原核表达质粒 pET-28a (+) 和大肠埃希菌 (E.coli) DH5 由

13、吉林大学第一医院转化医学研究院杨永广实验室保存。Trans1-T1 感受态细胞和 pEASY-T5 Zero Cloning Vector 购自北京全式金生物技术有限公司。BL21 (DE3) 购自北京鼎国生物技术有限责任公司。1.2 主要试剂和仪器限制性内切酶 Nco和 Xho购自美国 Thermo FisherScientific 公司, T4DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自美国 Promega 公司, 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工有限公司, 异丙基-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 购自美国 Sigma 公司, Ni Sepharose 4B 和 SephadexG-25 介质购自美国

14、 Amersham Pharmacia Biotech公司, DNA marker 和标准蛋白质 maker 购自北京全式金生物技术有限公司, 氨苄青霉素和卡那霉素购自美国 Amresco 公司, 小鼠抗多聚组氨酸标签 (His-tag) 单克隆抗体和辣根过氧化物酶 (HRP) 标记山羊抗小鼠抗体 IgG 购自北京全式金生物技术有限公司, 化学发光液 ECL 购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司。高压灭菌锅 (日本 SANYO 公司) , 电热恒温水箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司) , -80冰箱 (美国 Thermo Scientific 公司) , PCR

15、仪 (上海伯乐生命医学产品有限公司) , 恒温培养摇床 (上海一恒科学仪器有限公司) , 凝胶成像系统 (上海伯乐生命医学产品有限公司) , 超声波细胞粉碎机 (宁波新芝生物科技股份有限公司) 。1.3 PCR 引物的设计和合成根据弓形虫肌动蛋白 profilin 基因编码序列 (GenBank:AY937257.1) 设计 1 对引物。上、下游引物分别为 F:5-TCATTC CATGGCCAT-GTCCGACTGGGACCC TG-3和 R:5-ACT-GACTCGAGGTAC CCAGACTGGTGA AGA-3, 下划线为酶切位点, 并分别设计含有 Nco和 Xho的酶切位点。引物由上

16、海生工生物技术有限公司合成。1.4 肌动蛋白 profilin 基因的扩增以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 反应, 反应条件为:98、1 min;98、10s, 62、30s, 72、30s, 共 30 个循环;72、10 min 延伸。1.2%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。琼脂糖凝胶回收试剂盒回收和纯化 PCR 产物。1.5 原核表达质粒的构建1.5.1 基因片段的 TA 克隆和测序PCR 产物和 pEASY-T5Zero Cloning Vector 连接, 连接产物转化入 Trans1-T1感受态细胞中, 铺板, 培养过夜, 挑取多个单克隆送公司测序, 鉴定阳性重组子。1.5.2 阳性重

17、组子的鉴定选择形态较好的单克隆接种于含 LB/Kan+ (50gL) 的 5mL 液体培养基中, 于37C 剧烈振摇下培养过夜。采用试剂盒小量提取质粒, 应用 Nco和 Xho双酶切, 鉴定含有 profilin 基因片段的重组质粒 T5-profilin 基因。1.5.3 pET28a-profilin 重组质粒的构建和测序将 pET28a 空质粒和 T5-profilin 重组质粒用 Nco和 Xho双酶切消化, 琼脂糖凝胶回收 profilin 基因片段及线性化的 pET28a (5 369bp) 载体, 目的基因TgPRF 与载体质粒 pET-28a (+) 按摩尔比 51 (目的片段

18、载体) 将二者连接、转化入 E.coli DH5 感受态细胞, 涂布于含卡那抗性 (50mgL) 的平皿, 37孵箱培养 1216h, 挑取单克隆接种于 5mL 含卡那抗性 (卡那霉素使用浓度为 50gL) 的 LB 培养基中, 37摇床 225rmin, 振荡培养 1216h。试剂盒提取质粒, 并采用 Nco和 Xho双酶切处理, 电泳鉴定阳性重组质粒。阳性菌液送上海生工生物技术有限公司测序鉴定。同时设 pET28a 空质粒为阴性对照。1.6 重组蛋白的表达和纯化1.6.1 重组蛋白的表达和表达方式的鉴定测序鉴定序列正确后, 采用 pET28a-profilin 重组质粒转化入 BL21 (

19、DE3) 表达菌株, 涂布于含卡那抗性 (50mgL) 的平皿上, 37孵箱培养 1216 h。挑取单克隆接种于 20 mL 卡那抗性 (50mgL) 的 LB 培养基中, 37摇床225rmin, 振荡培养, 当 A (600) 达 0.50.8 时, 留取菌种和 1 mL 菌液作为诱导前对照。剩余菌液内加入终浓度为 0.5 mmolLIPTG, 37摇床 225rmin诱导表达 4h 后, 留取 1mL 诱导后菌液。分别将诱导前与诱导后菌液 11 000rmin 离心 2min, 沉淀用 100L 1还原 buffer 重悬, 沸水煮沸 10min, 11 000rmin 离心 5min,

20、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 鉴定表达产物。取 pET28a-profilin 重组质粒在 BL21 (DE3) 菌中诱导后的菌液 5mL 离心, 沉淀用裂解缓冲液 (tris 20mmolL, NaCL 0.5mmolL, 咪唑 20mmolL) 重悬, 放置于小瓶中超声裂菌。裂菌条件为:功率 600 W, 5s 工作, 5s 间歇, 超声 60次。采用结晶紫染色的方法观察菌体是否经超声裂解完全。如裂菌完全, 各取1mL 超声后菌液于 2 个 EP 管中, 11 000rmin 离心 30min。其中一管弃上清, 沉淀采用 100L1还原 buffer 重悬;另一管取

21、50L 上清, 加入 50L 2还原 buffer, 沉淀用 1mL 超纯水重悬后取 50L, 加入 50L 2还原 buffer, 将电泳的样品煮沸、离心, SDS-PAGE 鉴定表达方式。1.6.2 重组蛋白的纯化重组蛋白表达菌离心后, 菌沉淀用裂解缓冲液重悬, 采用金属螯合亲和层析法 (填料为 Ni Saphrose-4B) 纯化重组蛋白 (柱长 30cm, 直径 2.5cm, 填料高度10cm) 。葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 为填料进行凝胶过滤除盐 (除盐柱柱长100cm, 直径 2.5cm, 填料高度 80cm) 。洗脱纯化的蛋白并测定蛋白纯度和浓度 (洗脱条件:用平衡缓

22、冲液对 Ni Saphrose-4B 进行柱平衡, 缓慢上样后, 加入洗涤缓冲液进行洗涤, 洗涤至基线, 再加入样品洗脱缓冲液, 收集目标蛋白, 将收集的目的蛋白流经除盐柱进行除盐) 。1.7 Western blotting 法鉴定重组融合蛋白 His-profilin 的表达将 His-profilin 蛋白经 SDS-PAGE 分离、转膜和 5%脱脂奶粉封闭等程序后, 加入小鼠抗 His-tag 单克隆抗体 (15 000) 作为一抗, 4摇动孵育过夜, PBS-T 洗涤 3 次, 再加入山羊抗小鼠的 HRP-IgG (15 000) 作为二抗, 室温孵育1h, PBS-T 洗涤 3 次

23、, 采用 ECL 发光液显色并拍照。2 结果2.1 肌动蛋白 profilin 基因的 PCR 电泳PCR 产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳结果显示:在约 492bp 处有 1 条特异性扩增条带, 其相对分子质量与刚地弓形虫肌动蛋白 profilin 的 cDNA 序列大小相符, 结合测序结果, 证实该片段为 TgPRF 基因片段。见图 1。图 1 TgPRF 基因片段的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 Agarose gel electrophorogram of TgPRF gene fragment 下载原图M:DL2 000DNA marker;Lane 1:TgPRF fragment.2

24、.2 重组质粒 pET28a-profilin 的鉴定将 pEASY-T5-profilin 重组质粒采用 Nco和 Xho双酶切, 所得片段定向亚克隆置入 pET28a (+) 表达载体中, 经转化筛选, 挑取几个单克隆菌株, 提取质粒, 采用 Nco和 Xho双酶切。电泳结果显示, 在约 5 369bp 和 492bp 处分别出现条带, 与预期结果相符。提取的 pET28aprofilin 重组质粒送公司测序, 测序结果与设计的目的序列完全相同, 见图 2。图 2 重组质粒 pET28a-profilin 的双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.2 Agarose gel electrop

25、horegram of recombinant plasmid pET28a-profilin identified by double enzyme digestion 下载原图M1:DL2 000 DNA marker;M2:DL15 000 DNA marker;Lane 1, 3:pET28a-profilin;Lane 2, 4:pET28a-profilin digested by Ncoand Xho;Lane 5, 7:pET28avector (negative control) ;Lane 6, 8:pET28avector digested by Ncoand Xho (

26、negative control) .2.3 pET28a-profilin 重组蛋白的 SDS-PAGE 鉴定与诱导前比较, 诱导后出现 1 条相对分子质量约为 18 000 的蛋白条带 (图 3) , 与预测的蛋白质相对分子质量基本一致, 初步证实重组蛋白 profilin 在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中成功表达。应用带 His 标签的一抗对重组蛋白 TgPRF 进行Western blotting 鉴定, 在相对分子质量约为 18 000 处可见阳性条带, 而相应的未插入 profilin 基因的 pET28a 空质粒表达菌株诱导 4h 后, 在 18 000 条带处未见阳性条带

27、(图 4) , 进一步证实在大肠杆菌中表达的蛋白即是 TgPRF蛋白。SDS-PAGE 分析结果显示:重组蛋白主要在超声裂解菌体的上清中表达 (图 5) , 说明重组蛋白 TgPRF 在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中以可溶性形式表达, 为可溶性原核表达。2.4 纯化重组蛋白 TgPRF 的 SDS-PAGE 分析超声裂解表达重组蛋白 TgPRF 的菌体, 采用 Ni -Saphrose-4B 金属螯合亲合层析纯化重组蛋白, 纯化样品进行 SDS-PAGE 分析, 行考马斯亮蓝染色鉴定 (图 6) 。纯化蛋白在 SDS-PAGE 上呈现单一条带, 凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度大于 90

28、%, BCA 法测定蛋白浓度为 1gL。说明获得了较好纯度和浓度的目的蛋白。图 3 SDS-PAGE 法检测重组蛋白 TgPRF 表达的电泳图 Fig.3 Electrophoregram of expression of recombinant protein TgPRF detected by SDS-PAGE method 下载原图M:Protein marker;Lane 1:Before induction;Lane 2:After induction.图 4 Western blotting 法检测重组蛋白 TgPRF 表达的电泳图 Fig.4 Electrophoregram o

29、f expression of recombinant protein TgPRF detected by Western blotting method 下载原图Lane 1:Whole proteins of pET28a bacteria without induction (negative control) ;Lane 2:Whole proteins of pET28abacteria with induction (negative control) ;Lane 3:Whole proteins of bacteria without induction;Lane 4:His-p

30、rofilin.图 5 SDS-PAGE 法检测 TgPRF 蛋白诱导表达形式的电泳图 Fig.5 Electrophoregram of inducible expression patterns of TgPRF protein detected by SDS-PAGE method 下载原图M:Protein marker;Lane 1:Before induction;Lane 2:After induction;Lane 3:Supernatant of induced BL21;Lane 4:Supernatant of induced BL21 (2fold dilution)

31、;Lane 5:Supernatant of induced BL21 (4fold dilution) ;Lane 6:Supernatant of induced BL21 (8fold dilution) ;Lane 7:Deposition of induced BL21;Lane 8:Deposition of induced BL21 (2fold dilution) .图 6 SDS-PAGE 法检测纯化重组蛋白 TgPRF 表达电泳图 Fig.6 Electrophoregram of expressions of purified recombinant protein Tg

32、PRF detected by SDS-PAGE method 下载原图M:Protein marker;Lane 1:Precipitation after squeeze and centrifuge;Lane 2:Supernatant liquid after squeeze and centrifuge;Lane 3:Flow through;Lane 4:Washing buffer;Lane 5:Before elution;Lane 6:Elution of post-peak;Lane 7:After elution;Lane 8:Protein samples after

33、demineralization;Lane 9:After induction with 0.5mmolL-1 IPTG.3 讨论TgPRF 基因突变或缺失将阻碍弓形虫滑动, 无法完成对宿主的侵袭和感染, 从而影响弓形虫的毒力和对宿主的抗弓形虫免疫。因此 profilin 蛋白可作为抗弓形虫药物的靶位点或疫苗的候选基因。研究13显示:将 TgPRF 包裹在甘露糖脂质 (TgPF-OML) 体内, 注射给感染弓形虫的 C57BL/6 小鼠, 可明显延长小鼠的生存周期和减小脑部损伤, 诱导 TgPRF 依赖的特异性 IFN- 和抗体 IgG 的产生, 引发强烈的抗弓形虫体液和细胞免疫反应。但是这一

34、过程依赖髓样分化因子 88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88) 信号通路和 TLR11 受体分子。人和猪等动物中并不存在 TLR11, 在感染弓形虫的猪血清中检测到 anti-TgPF抗体, 暗示在缺少 TLR11 的物种中 TgPRF 的免疫原性被提高, TgPF-OML 可能在缺乏 TLR11 的物种中参与抗弓形虫的感染免疫, 但需要更多的科学研究支持。TgPRF 处理的细胞能诱导抗原提呈和适应性 T 细胞免疫反应, 可作为一种新的肿瘤疫苗佐剂14。弓形虫感染过程中可通过增加树突状细胞 (DCs) 、巨噬细胞、自然杀伤细胞 (NK) 、CD

35、4 和 CD8T 细胞的数量诱导肿瘤免疫反应, 通过Th1 免疫反应, 活化细胞毒性 T 细胞, 减缓肿瘤的生长速度15-17。采用分泌的 TgPRF 抗原治疗 B16 荷瘤小鼠, 可明显减缓肿瘤的生长速度和增加细胞免疫反应18。Pyo 等14应用小鼠结肠癌细胞系的自体整个肿瘤细胞疫苗 (autologous wholetumor-cell vaccine, AWV) 模型研究显示:TgPRF 可增加抗原提呈分子 (如 MHCs/) 及其共刺激分子受体 (CD80 和 CD86) 的表达, 诱导抗肿瘤免疫和吞噬作用。TgPRF 和 AWV 共同作用可提高疫苗的效果, 减缓肿瘤的生长速度, 提高

36、荷瘤者的生存率。但现有的多种抗弓形虫疫苗均受到安全性和保护效力不充分的限制, 未能应用于临床。本实验成功构建了重组质粒 pET28a (+) -profilin 的原核表达体系, 并实现了重组蛋白 TgPRF 的可溶性表达和高度纯化, 为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究奠定了基础。参考文献1Ovciarikova J, Lemgruber L, Stilger KL, et al.Mitochondrial behaviour throughout the lytic cycle of Toxoplasma gondiiJ.Sci Rep, 2017, 7:42746.doi:10.1038/srep

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40、 of membrane proteins in Toxoplasma gondiiJ.Mol Cell Proteomics, 2011, 10 (1) :1-14. 7Alam A, Bhatnagar RK, Relan U, et al.Proteolytic activity of Plasmodium falciparum subtilisin-like protease 3on parasite profilin, a multifunctional proteinJ.Mol Biochem Parasitol, 2013, 191 (2) :58-62. 8Koblansky

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