1、论著 急性髓性白血病CEBPA基因突变的检测及临床意义阮国瑞 江滨 牛继红 李玲娣 李金兰 黎宁 冷馨 赖悦云 石红霞许兰平 刘艳荣 陈珊珊 黄晓军【摘要 】 目的 研究急性髓性白血病 ( acute myeloid leukemia， AML) 髓系转录因子 CCAAT 增强子结合蛋白 -A( CCAAT-enhancer binding protein-alpha， CEBPA) 基因突变的检出率及其临床意义 。方法 采用聚合酶链式反应 ( polymerase chain reaction， PCR) 扩增产物片段长度分析及序列分析方法检测 123 例初治正常核型 AML 患者 CEBP
2、A 基因全部编码区突变情况 。结果 在 123 例正常核型AML 患者中发现 CEBPA 基因突变 32 例 ， 包括 3 例 FAB 分型 M1 中 1 例 ， 58 例 M2 中 23 例 ( 检出率为39. 7%) ， 19 例 M4 中 4 例 ( 检出率为 21. 1%) ， 14 例 M5 中 2 例 ( 检出率为 14. 3%) 及 7 例 M6 中 2 例 ，而在 2 例 M0、19 例 M3、及 1 例 M7 中未发现 CEBPA 基因突变 ， 总检出率为 26. 0%。其中在 M2 中检出率高于在 M3 中的检出率 ( P 0. 05) ， 而与在 M4、M5 中的检出率没
3、有差别 ( P 均 0. 05) 。CEBPA基因突变与较高的骨髓幼稚细胞数 、较低的外周血血小板数明显相关 ( P 0. 05) ， 而与外周血血红蛋白及白细胞数没有明显相关 ( P 0. 05) 。结论 在排除了所有已知的多态性位点后 ， CEBPA 突变在123 例正常核型 AML 中的总检出率为 26. 0%， 其中在 M2 中检出率高于在 M3 中的检出率 。CEBPA基因突变阳性患者有较高的骨髓幼稚细胞数 ， 而外周血血小板数明显降低 。【关键词 】 白血病 ， 髓样 ， 急性 ; 聚合酶链反应 ; 序列分析 ; CEBPA 基因突变 ; 片段长度分析Detecion of CEB
4、PA gene mutations in acute myeloid leukaemia and its clinic significance RUAN Guo-rui， JIANG Bin， NIU Ji-hong， LI Ling-di， LI Jin-lan， LI Ning， LENG Xin， LAI Yue-yun， SHI Hong-xia， XU Lan-ping， LIU Yan-rong， CHEN Shan-shan， HUANG Xiao-jun Peking University Peoples Hospital and Institute ofHematology
5、， Beijing Key Laboratory of Hematopoietic Stem Cell Transplantation， Beijing 100044， ChinaCorresponding author: RUAN Guo-rui， Email: ruanguorui pkuph edu cn【Abstract】 Objective To investigate the detection rate of CEBPA ( CCAAT-enhancer bindingprotein-alpha， CEBPA) mutations in acute myeloid leukemi
6、a( AML) and its clinic significance MethodsThe entire coding region of the CEBPA gene was detected in 123 untreated AML patients with normalkaryotype using polymerase chain reaction( PCR) followed by sequence analysis and fragment length analysis38 normal donors from the allogeneic stem cell transpl
7、antation were served as control Results 32 cases withCEBPA mutation were found in 123 AML patients with normal karyotype， including 1 in 3 cases of theFrench-American-British( FAB) subtype M1， 23 in 58 cases of M2( 39. 7%) ， 4 in 19 cases of M4( 21. 1%) ，2 in 14 cases of M5( 14. 3%) and 2 in 7 cases
8、 of M6 No mutation was found in 2 with M0， 19 with M3， and1 with M7 The total detection rate of CEBPA mutations was 26. 0% in 123 AML patients with normalkaryotype The detection rate was higher in M2 than that in M3( P 0. 05) ， but the result in M2 was notstatistically significant compared with that
9、 in M4 or M5 ( both P 0. 05) Moreover， CEBPA mutations weresignificantly associated with a higher blast counts in the bone marrow and lower platelet counts in theDOI: 103877/cma j issn1674-0785201117014基金项目 : 北京大学人民医院研究与发展基金 ( RDC2010-11) ; 国家高科技研究发展项目 ( 863 计划 )( 2006AA02A405)作者单位 : 100044 北京大学人民医院
10、血液病研究所 造血干细胞移植治疗血液病北京市重点实验室通讯作者 : 阮国瑞 ， Email: ruanguorui pkuph edu cn7894中华临床医师杂志 ( 电子版 ) 2011 年 9 月第 5 卷第 17 期 Chin J Clinicians( Electronic Edition) ， September 1， 2011， Vol5， No17peripheral blood( both P 0. 05) ， but not hemoglobin and white blood cell counts in the peripheral blood( both P 0. 0
11、5) Conclusions A total of 32( 26. 0%) out of 123 screened AML patients with normalkaryotype are found to carry CEBPA mutations after excluding all known CEBPA polymorphisms Thedetection rate is higher in M2 than that in M3 Patients with CEBPA mutations have a higher blast counts inthe bone marrow an
12、d a lower platelet counts in the peripheral blood【Key words】 Leukemia， acute， myeloid; Polymerase chain reaction; Sequence analysis;CCAAT/enhancer binding protein alpha mutation; Fragment length analysis由基因突变导致的细胞增殖 、分化和细胞凋亡途径的改变是急性髓性白血病 ( acute myeloid leukemia，AML) 的发病基础 。近来在正常核型 AML 中鉴定出了多种有重要预后价
13、值的分子标记 1-3， 其中髓系转录因子 CCAAT 增强子结合蛋白 -A( CCAAT-enhancer binding protein-alpha， CEBPA) 在造血系统中只表达于髓系细胞 ， 是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子 ， 具有诱导粒系的分化和抑制增生的作用 。在新修订的 WHO 白血病分类标准中 4， CEBPA 突变的检测已成为 AML 重要的诊断 、分层 、预后参考指标 ， 可能成为新的治疗靶点 。我们在建立了 CEBPA 基因全部编码区测序及 PCR 扩增产物片段长度分析两种检测方法的基础上 5， 进一步研究了 CEBPA 基因突变在 123 例正常核型
14、AML 患者中的检出率及其临床意义 。对象与方法1. 研究对象 : 正常核型 AML 患者 123 例 ， 选自 2007 年 1 月至 2010 年 1 月在北京大学人民医院就诊的初诊病例 ， 其中男 71 例 ， 女 52 例 ， 年龄 14 86 岁 ， 中位年龄 43 岁 。诊断标准依据急性白血病 FAB 分型标准 6， 其中 FAB 分型 M0 2 例 ， M1 3 例 ， M2 58 例 ， M3 19 例 ， M4 19 例 ， M5 14 例 ， M6 7 例 ， M7 1 例 。同时期来自北京大学人民医院的 38 例正常人作为对照组 。本研究获得北京大学人民医院医学伦理委员会
15、批准 ， 遵循赫尔辛基宣言 。2. 待测样品制备 : 123 份患者骨髓标本及 38 例正常人骨髓或外周血标本 ， 参照 DNA zol 试剂盒 ( Invitro-gen 公司 ) 说明书在无菌条件下提取基因组 DNA。具体方法为 : 利用 Na2EDTA 抗凝 ， 利用淋巴细胞分层液( 相对密度 1. 077 g/L， 上海华精高科技有限公司 ) 分离出单个核细胞 ， 将分离出的单个核细胞用生理盐水洗涤 2 次后 ， 加入 600 l DNA zol 试剂 ， 参照试剂盒说明书提取 DNA， 在 ND-1000 分光光度计上检测浓度 ( Nan-oDrop 科技有限责任公司 ) ， 所有用
16、于 PCR 的 DNA 样本的 260280 比值均 1. 8。3. PCR 扩增 CEBPA 基因 、序列分析及其片段长度分析 : 实验中扩增 CEBPA 基因全部编码区所用的四对荧光标记的引物序列参照文献 7， 由上海基康有限公司合成 ， 同时合成不携带标记基团的 4 对引物 。以待测者的 DNA 为模板 ， 分别用以上四对荧光标记的引物或不携带标记基团的四对引物进行扩增 ， 分别可以得到四种扩增产物 ， 其中利用不含荧光标记的引物扩增的产物用于测序分析 ， 利用含荧光标记的引物扩增的产物用于片段长度分析 。不同片段的 PCR 扩增体系及扩增条件参见我们已发表的文献 5。PCR 扩增产物经
17、纯化后 ， 由上海基康有限公司利用下游引物在 ABI3700 DNA 分析仪上完成测序工作 。测序结果与美国国家生物技术信息中心 ( National Center for Biotechnology Information， NCBI) 基因库序列 ( NM_004364. 2) 进行比对 。含荧光标记的引物扩增的产物用于片段长度分析 ， 在 ABI PRISMTM 3730 DNA 分析仪上 ， 使用 Ge-neScan 程序电泳 ， 电泳数据经 Genemapper 软件 ( 3. 7 版 ) 处理后得到检测片段大小 。4. 检测 FLT3-ITD、NPM1 突变及染色体核型分析 : 检
18、测 NPM1、FLT3-ITD 突变的方法参见文献 8 。利用 G 显带技术对患者骨髓标本进行染色体分析的方法参见文献 9 。5. 诱导治疗 : 在 123 例患者中 ， 除了 19 例 M3( M3 有独立的治疗方案 ) 以外 ， 30 例没有可利用的资料 ，其余 74 例诱导缓解化疗方案为柔红霉素 + 阿糖胞苷或高三尖杉酯碱 + 阿糖胞苷 8。6. 数据分析 : 使用 SPSS 11. 0 软件 ( Chicago， IL， USA) 进行统计学分析 。卡方检验用于评估两组间检出率的显著性 ， 两组间差异应用单因素方差分析 。P 0. 05 被认为具有统计学差异 。结 果1. CEBPA
19、基因突变在 123 例正常核型 AML 患者中的检出率 : 在 123 例正常核型 AML 患者中发现8894 中华临床医师杂志 ( 电子版 ) 2011 年 9 月第 5 卷第 17 期 Chin J Clinicians( Electronic Edition) ， September 1， 2011， Vol5， No17CEBPA 基因突变 32 例 ( 表 1) ， 包括 3 例 FAB 分型 M1 中 1 例 ， 58 例 M2 中 23 例 ( 检出率为 39. 7%) ， 19 例M4 中 4 例 ( 检出率为 21. 1%) ， 14 例 M5 中 2 例 ( 检出率为 14
20、. 3%) 及 7 例 M6 中 2 例 ， 而在 2 例 M0、19 例M3 及 1 例 M7 中未发现 CEBPA 基因突变 ， 总检出率为 26. 0%。其中在 M2 中检出率高于在 M3 中的检出率( P 0. 05) ， 而与在 M4、M5 中的检出率没有差别 ( P 均 0. 05) 。在 38 例正常人中 ， 除了检出 8 例存在CEBPA 基因第 584 589 位多态性位点外 ， 没有检出 CEBPA 基因突变 。表 1 CEBPA 基因突变在 123 例 AML 患者中的检出率MIC 分型 例数 突变型 ( 例 ) 野生型 ( 例 ) 突变检出率 ( %)M0 2 0 2
21、bM1 3 1 2 bM2 58 23 35 39. 7aM3 19 0 19 0M4 19 4 15 21. 1M5 14 2 12 14. 3M6 7 2 5 bM7 1 0 1 b合计 123 32 91 26. 0注 : MIC: 形态学 、免疫学及细胞遗传学 ; 与 M3 比较 ，aP 0. 05;b: 由于总例数 10， 所以只列出例数2. CEBPA 基因突变患者的临床特征 : CEBPA 基因突变阳性及野生型患者的资料总结于表 2 中 ， 其中CEBPA 基因突变阳性患者男 21 例 ( 年龄 20 86 岁 ) ， 女 11 例 ( 年龄 20 71 岁 ) ， 在男性患者中
22、检出率高于女性患者 ， 但无统计学差异 ( P 0. 05) 。在 32 例 CEBPA 基因突变阳性患者中 ， 26 例为单一位点突变 ， 6 例为两个位点的突变 ， 共 38 个突变位点 ， 均为插入或缺失突变 。同时检出 2 例伴有 FLT3-ITD 基因突变 ， 2 例具有 NPM1 基因突变 ， 其中包括 1 例同时检出伴有 FLT3-ITD 及 NPM1 基因突变 。FLT3-ITD、NPM1 基因突变在 CEBPA 基因野生型患者组的检出率均高于 CEBPA 基因突变阳性患者组 ， 但均没有发现有统计学意义的差别 ( P 均 0. 05) 。CEBPA 基因突变阳性患者的骨髓幼稚
23、细胞数高于野生型患者组 ( P 0. 05) ， 其外周血血小板数明显低于野生型患者组 ( P 0. 05) ， 而外周血血色素水平及白细胞数二者间没有明显差别 ( P 0. 05) 。在 123 例患者中 ， 除了 19 例 M3 以外 ， 30 例没有可利用的资料 ， 在可分析的 74 例患者中 ， 23 例为 CEBPA 阳性患者 ， 51例为 CEBPA 阴性患者 ， 诱导缓解率分别为 78. 3%( 18/23) 、72. 5%( 37/51) ， 没有统计学差异 ( P 0. 05) 。表 2 CEBPA 基因突变阳性与阴性患者的临床特点分型 例数平均年龄( 岁 )性别 例 ，(
24、%) 男 女骨髓幼稚细胞 ( %，珋x s)白细胞( 109/L，珋x s)血红蛋白( g/L，珋x s)血小板( 109/L，珋x s)CEBPA 突变型 32 40. 9 21( 65. 6) 11( 34. 4) 62. 9 19. 1 28. 1 29. 3 79. 9 31. 5 37. 0 30. 0CEBPA 野生型 91 43. 2 50( 54. 9) 41( 45. 1) 52. 0 23. 4 25. 25 50. 0 77. 85 30. 0 92. 1 125. 2P 值 0. 490 0. 05 0. 048 0. 790 0. 759 0. 0142值 1. 11
25、分型FLT3-ITDa 例 ，( %) 突变型 野生型NPM1b 例 ，( %) 突变型 野生型诱导治疗c 例 ，( %) 缓解 未缓解CEBPA 突变型 2( 6. 2) 30( 93. 8) 2( 6. 2) 30( 93. 8) 18( 78. 3) 5( 21. 7)CEBPA 野生型 9( 12. 3) 64( 87. 7) 13( 17. 3) 62( 82. 7) 37( 72. 5) 14( 27. 5)P 值 0. 05 0. 05 0. 052值 0. 35 1. 46 0. 27注 :a、b、c: 分别有 18、16 及 30 例没有可利用的资料 ， 其中 c 中还排除了
26、 19 例 M3 亚型9894中华临床医师杂志 ( 电子版 ) 2011 年 9 月第 5 卷第 17 期 Chin J Clinicians( Electronic Edition) ， September 1， 2011， Vol5， No17讨 论在 2008 版新修订的 WHO 分类标准中 ， 已将 NPM1 和 CEBPA 突变的 AML 各归为暂定的独立 AML 亚型 ， FLT3、NPM1 和 CEBPA 突变也已成为 AML 重要的预后参考指标 。NPM1 和 FLT3 突变已成为常规诊断项目 ， 而 CEBPA 突变类型多样 ， 且突变分布在 CEBPA 基因的全部编码区 、
27、序列片段长 、GC 含量高 ， 尽管核苷酸测序是检测基因突变的金标准 ， 但针对 CEBPA 突变的测序耗时长 ， 难度大 7。我们在对 107 例 AML 患者及 38 例正常人测序的基础上 ， 建立了 PCR 扩增产物片段长度分析的方法 5， 可敏感准确的检测出一个碱基的缺失或插入突变 ， 测序结果与片段长度分析的结果一致 ， 我们进一步利用该方法在 123 例正常核型 AML患者中 ， 排除已知的多态位点以后 ， 共发现 CEBPA 基因突变 32 例 ， 总检出率为 26. 0%， 高于国外文献报道的在正常核型 AML 中约占 15% 18%的发生率 10， 检出率高的原因之一可能是我
28、们研究的 123 例正常核型 AML 病例中 ， M2 病例占了多数 ( 58 例 ) ， 其在 58 例 FAB-M2 中检出率为 39. 7%， 与国外文献报道相近 。此外 ， 我们使用了覆盖 CEBPA 基因全部编码区的四对引物分别对 CEBPA 基因进行扩增 ， 并通过进行测序及毛细管电泳片段长度分析两种方法检测该突变情况 ， 也可能是检出率高的原因之一 。在我国 AML 患者中CEBPA 基因突变检出率是否确实高于西方国家 ， 尚需扩大病例数验证 。我们也发现 32 例 CEBPA 基因突变阳性的患者中 ， 男性患者 21 例 ( 年龄范围 20 86 岁 ) ， 女性 11 例 (
29、 年龄范围 20 71 岁 ) ， 在男性患者中的突变检出率高于女性患者 ， 但没有统计学意义的差别 ( P 0. 05) 。文献报道有 CEBPA 基因突变的 AML 往往表现血红蛋白量较高 ， 血小板数较低 ， 外周血原始细胞数较高 4， 10。我们的结果发现 CEBPA 基因突变阳性患者的骨髓幼稚细胞数高于野生型患者组 ( P 0. 05) ， 其外周血血小板数明显低于野生型患者组 ( P 0. 05) ， 而外周血血红蛋白水平二者间没有明显差别 ( P 0. 05) ， 其外周血白细胞数高于野生型患者 ， 但没有发现统计学意义 ( P 0. 05) ， 这可能与所研究病例数不多有关 。
30、在可分析的74 例患者中 ， 23 例 CEBPA 阳性患者与 51 例 CEBPA 阴性患者的诱导缓解率没有明显差别 ( P 0. 05) ， 这与文献报道的相同 11-12， 但除了 Snaddon 等 11以外 ， 多数文献报道 12CEBPA 阳性患者有较好的无病存活率或总生存率 ， 由于我们观察时间较短 ， 尚未分析该数据 。此外 ， 在 32 例 CEBPA 基因突变阳性患者中 ， 我们同时检出 2 例伴有 FLT3-ITD 基因突变 ， 2 例具有 NPM1 基因突变 ， 其中包括 1 例同时检出伴有 FLT3-ITD 及NPM1 基因突变 。在 2008 版新修订的 WHO 分
31、类标准中 ， 这三种突变已成为 AML 重要的预后参考指标 ，CEBPA 基因突变与 NPM1 突变相同 ， 如不伴 FLT3-ITD 突变 ， 则是预后好的标志 ， 而 FLT3-ITD 突变与 CEBPA突变共存的 AML 预后不良 ， 同时存在这三种突变的预后如何 ， 尚需进行更多的研究 。总之 ， 我们的结果显示在正常核型 AML 患者中约 1/4 可检出 CEBPA 基因突变 ， 少数患者中与 NPM1 和FLT3-ITD 基因突变并存 。CEBPA 基因突变检测有利于 AML 的分层诊治和预后判断 ， 在初诊评估时就应对骨髓样本进行全面的细胞遗传学分析 ， 以利于 AML 患者的分
32、子分型 、个体化诊疗和预后预测 。参 考 文 献 1 Trivedi AK， Bararia D， Christopeit M， et al Proteomic identification of C/EBP-DBD multiprotein complex: JNK1 activates stem cell regulator C/EBPa by inhibiting its ubiquitination Oncogene， 2007， 26: 1789-1801 2 Preudhomme C， Sagot C， Boissel N， et al Favorable prognostic s
33、ignificance of CEBPA mutations in patients with de novo acute myeloid leuke-mia: a study from the Acute Leukemia French Association( ALFA) Blood， 2002， 100: 2717-2723 3 Ho PA， Alonzo TA， Gerbing RB， et al Prevalence and prognostic implications of CEBPA mutations in pediatric acute myeloid leukemia(
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