1、光肩星天牛气味结合蛋白 AglaOBP12 的基因克隆、表达及配体结合特征 李广伟 陈秀琳 尚天翠 伊犁师范学院生物与地理科学学院 摘 要： 【目的】克隆和鉴定光肩星天牛 Anoplophora glabripennis 气味结合蛋白 (odorant binding proteins, OBPs) 基因, 明确其表达特点及与寄主植物挥发物的结合特性, 有助于阐明光肩星天牛嗅觉识别的分子机制。【方法】根据光肩星天牛雌成虫触角转录组数据, 利用 RT-PCR 克隆 OBP12 基因, 并进行生物信息学分析。通过实时定量 PCR (qRT-PCR) 测定 OBP12 在光肩星天牛成虫触角、头 (移
2、除触角) 、胸、腹、足、翅中的转录水平。利用原核表达系统和 Ni 离子亲和层析技术表达和纯化 OBP12 重组蛋白, 荧光竞争结合实验测定重组蛋白与39 种气味配体的结合能力。【结果】获得光肩星天牛气味结合蛋白基因AglaOBP12 (GenBank 登录号:KX890109) 的完整编码序列, 其开放阅读框长 414 bp, 编码 137 个氨基酸, N 末端具有 18 个氨基酸组成的信号肽序列, 蛋白序列具有 6 个保守的半胱氨酸残基, Agla OPB12 属于 Classical OBPs 亚家族基因。qRT-PCR 测定结果表明, AglaOBP12 主要在成虫触角中表达, 在其他组
3、织微量表达。在待测的 39 种寄主植物挥发物中, 重组蛋白 AglaOBP12 仅与 19 种化合物具有结合活性, 表明 AglaOBP12 对寄主植物挥发物具有明显的选择结合特性。重组蛋白 AglaOBP12 与十二烷醇、十四烷醇、法尼醇、十二醛、乙酸-顺-3-己烯酯和 -石竹烯的结合能力较强, 结合常数分别为 1.96, 0.96, 1.03, 0.82, 0.77 和 0.74mol/L。【结论】明确了 AglaOBP12 的核苷酸和氨基酸序列组成, 重组 AglaOBP12 蛋白与主链有 12 个碳原子的醇类、醛类和萜烯类挥发物有特异性的结合活性。根据 AglaOBP12 基因的表达特
4、点和重组蛋白的结合特性, 推测AglaOBP12 在光肩星天牛成虫定位补充营养寄主植物中发挥重要作用。关键词： 光肩星天牛; 气味结合蛋白; 嗅觉; 基因表达; 荧光竞争结合实验; 作者简介：李广伟, 男, 1982 年生, 甘肃会宁人, 博士, 助理研究员, 研究方向为农业害虫综合治理;E-mail:收稿日期：2017-04-08基金：新疆维吾尔自治区自然科学基金 (2015211C299) cDNA cloning, expression and ligand binding properties of the odorant binding protein AglaOBP12 in th
5、e Asian longhorned beetle, Anoplophora glabripennis (Coleoptera:Cerambycidae) LI Guang-Wei CHEN Xiu-Lin SHANG Tian-Cui College of Biology and Geography, Yili Normal University; Abstract： 【Aim】Cloning and identification of the odorant binding protein (OBP) genes and clarifying their expression featur
6、es and ligand-binding characteristics with host-plant volatiles are helpful to address the molecular mechanisms of olfaction in the Asian longhorned beetle, Anoplophora glabripennis.【Methods】Based on the antenna transcriptome data of A.glabripennis female adult, the complete coding sequence of OBP12
7、 was cloned using RT-PCR and bioinformatically analyzed.The expression levels of OBP12 in the antenna, head (without antennae) , thorax, abdomen, leg and wing were assayed by real-time quantitative PCR (qRT-PCR) .The recombinant OBP12 protein was prokaryotically expressed and then purified by Ni ion
8、 affinity chromatography.The binding affinities of the recombinant OBP12 with 39 ligands were assessed by using fluorescent competitive binding assay.【Results 】 AglaOBP12 of A.glabripennis was successfully cloned and sequenced (GenBank accession no.:KX890109) .Its ORF is414 bp in length, encoding 13
9、7 amino acids with the signal peptide of 18 amino acids at the N-terminal.The matured protein possessed six conserved cysteines and could be classified into the Classical OBP subfamily.qRT-PCR results showed that AglaOBP12 primarily expressed in the antenna and slightly expressed in other tissues.Am
10、ong the 39 chemicals tested, the recombinant AglaOBP12 had only binding activities to 19 compounds, suggesting that AglaOBP12 has obvious selective binding characteristics to host plant volatiles.The recombinant AglaOBP12 showed higher binding affinities to dodecanol, tetradecanol, farnesol, dodecan
11、al, cis-3-hexenyl acetate and -caryophyllene, with the Kivalues of1.96, 0.96, 1.03, 0.82, 0.77 and 0.74 mol/L, respectively.【Conclusion 】The nucleotide and deduced amino acid sequences of AglaOBP12 were characterized in this study.AglaOBP12 shows particularly strong binding affinities to alcohols, a
12、ldehydes and terpenes with 12 carbon atoms in the main-chain.Based on the results of qRT-PCR and fluorescent competitive binding assay, we speculated that AglaOBP12 in the Asian longhorned beetle plays an important role in locating trophic host plants.Keyword： Anoplophora glabripennis; odorant bindi
13、ng protein; olfactory; gene expression; fluorescence competitive binding assay; Received： 2017-04-08光肩星天牛 Anoplophora glabripennis (鞘翅目:天牛科) 是我国林木上一种重要的毁灭性蛀干害虫, 主要危害杨 Populus spp., 柳 Salix spp., 槭 Acer spp., 榆 Ulmus spp.和胡桃 Juglans spp.等属的多种树种 (李国宏等, 2010) 。该虫虽然寄主广泛, 但成虫对寄主植物有明显的取食和产卵偏好, 如嗜食五角枫 Acer
14、 mono 嫩梢, 更偏好在旱柳 Salix matsudana 上产卵, 灵敏的嗅觉系统在成虫定位补充营养寄主、产卵寄主植物中起着重要作用 (Yan et al., 2008) 。前人已在寄主植物挥发物鉴定、对成虫有电生理活性的挥发物组分的筛选等方面做了大量研究 (金幼菊等, 2004;Nehme et al., 2010;范丽清等, 2012, 2013;Meng et al., 2014;杜和芬等, 2016;王紫薇等, 2016;朱宁等, 2017) 。深入探究光肩星天牛嗅觉相关蛋白基因的生理功能, 阐明该虫嗅觉识别的分子机制, 将有助于推动光肩星天牛行为调控技术的开发和应用。气味结合
15、蛋白 (odorant binding proteins, OBPs) 能够选择性地结合和运输疏水性的气味分子穿过触角感器淋巴液至位于嗅觉感受神经元 (olfactory receptor neurons, ORNs) 树突膜的气味受体 (odorant receptors, ORs) 上, 激活嗅觉信号传导途径, 是昆虫感知外界环境的基础 (Justice et al., 2003;Pelosi et al., 2006) 。依据序列的同源性可将昆虫 OBPs 分为性信息素结合蛋白 (pheromone binding proteins, PBPs) 、普通气味结合蛋白 (general o
16、dorant binding proteins, GOBPs) 和触角结合蛋白 (antennal binding proteins, ABPx) 3 类 (Hekmat-Scafe et al., 2002) ;根据氨基酸序列中保守半胱氨酸数量可将 OBPs 分为 Classical OBPs, Plus-C OBPs, Dimer OBPs, Minus-C OBPs 和 Atypical OBPs 5 类 (Manoharan et al., 2013) 。随着基因组和转录组测序技术的快速发展, 已在鳞翅目、直翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目等 7 个目的多种昆虫触角中鉴定到大量的
17、OBPs 基因, 并利用荧光竞争结合实验测定了 200 多种昆虫 OBPs 的结合功能 (Zhou et al., 2004;Gong et al., 2007;Vandermoten et al., 2011;Deng et al., 2012;Li et al., 2015, 2017;Ahmed et al., 2017) 。目前, 对光肩星天牛嗅觉相关蛋白基因功能的研究甚少。Hu 等 (2016) 利用转录组测序在光肩星天牛成虫触角中鉴定到 42 种气味结合蛋白, 12 种化学感受蛋白 (chemosensory proteins, CSPs) , 37 种气味受体 (odorant
18、receptors, ORs) , 2 种嗅觉感受神经元膜蛋白 (sensory neuron membrane proteins, SNMPs) 和 14 种气味降解酶 (odorant degrading enzymes, ODEs) ;李广伟等 (2017a) 研究表明, 光肩星天牛气味结合蛋白基因除主要在触角中表达外, 在头、胸、腹、足、翅的个别组织中也有表达;王菁桢等 (2017) 鉴定了光肩星天牛性信息素结合蛋白 PBP1和 PBP2 基因, 并对两种 PBPs 基因在成虫身体不同部位的表达特点进行分析。基于光肩星天牛触角转录组数据分析, 发现触角候选 OBP12 基因在转录组中的
19、RPKM (每百万个 reads 中来自某基因每千碱基长度的 reads 数, Reads per kilobase per million mapped reads) 值相对较高。为了进一步研究 Agla OBP12 的生理功能, 本研究首先克隆了该基因的完整编码序列, 测定了该基因在成虫不同组织的表达特点, 通过异源原核表达和蛋白纯化获得 Agla OBP12 重组蛋白, 利用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与 39 种气味配体的结合能力, 以期加深对光肩星天牛的嗅觉识别机制的了解。1 材料与方法1.1 供试昆虫光肩星天牛幼虫采自新疆伊宁市 (采集时间:2016 年 5 月 26 日) , 寄
20、主植物为五角枫。将受光肩星天牛幼虫危害的五角枫枝干截成 5080 cm 的短枝, 带回实验室后装入纱网 (30 目) 系紧袋口并喷水保湿。待成虫羽化后将雌雄分开并置于人工气候箱内饲养, 饲养条件:温度 261, 相对湿度 40%60%, 光周期15L9D, 成虫以饲喂五角枫嫩枝补充营养。1.2 主要试剂和仪器1.2.1 主要试剂:总 RNA 提取试剂 RNAiso Plus, 反转录试剂盒 Reverse Transcriptase M-MLV, Ex Taq DNA 聚合酶, 实时荧光定量试剂盒 SYBRPremix Ex Taq, 内切酶 Bam H和 Hind, 克隆载体 p MD19-
21、T, DNA marker DL2000 和低分子量蛋白Marker 购自 Ta KaRa 公司;质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自 Omega 公司;感受态细胞 DH5, BL21 (DE3) 和表达载体 p ET28a (+) 购自全式金生物科技有限责任公司;His 标签亲和层析柱及填料、免疫印迹化学发光试剂 (超灵敏型) 购自七海复泰生物科技有限公司;抗 His 标签鼠单克隆抗体购自康为世纪有限公司;羊抗鼠二抗 Ig G (H+L) 购自 Jackson 公司;荧光探针 N-苯基-1-萘胺 (N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN) 购自 TCI;39 种挥发物的化
22、学合成品购自Sigma-Aldrich, Aladdin, Macklin, Alfa 和 TCI 试剂公司, 其他无机或有机试剂均为国产或进口分析纯。1.2.2 主要仪器:PCR 仪 (Gene Amp PCR system9700, Gene limited company) ;实时荧光定量PCR 仪 (i Q5, Bio-Rad) ;荧光分光光度计 (日立 F-4500, 日本经营电子电器有限公司) ;核酸蛋白浓度测定仪 (Simpli Nano, GE) ;全波长酶标仪 (Bio-Tek, Biotek 公司) ;UVP 凝胶成像系统 (UVP 公司) 。1.3 RNA 提取及 c D
23、NA 模板合成收集光肩星天牛 5 日龄雌、雄成虫的触角、头部 (移除触角) 、胸部、腹部、足和翅, 其中触角、足和翅各收集 20 对, 头和胸各 10 枚, 腹 5 枚, 每个样品3 次重复。将收集到的样品立即置于用液氮冷却处理过的小型研钵中研磨, 参照 RNAiso Plus (Ta KaRa) 提供的说明书提取总 RNA, 核酸蛋白浓度测定仪测定总 RNA 浓度及 OD260/OD280值, 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。DNase除去总 RNA 中的基因组 DNA 后用 M-MLV 反转录酶合成 c DNA 第 1 链, -80保存备用。1.4 光肩星天牛气味结合蛋白基
24、因克隆以光肩星天牛雌虫触角 c DNA 为模板, 根据光肩星天牛雌虫触角转录组测序注释到的候选 OBP12 基因序列设计特异性引物 (表 1) 扩增其完整编码序列, PCR反应体系和扩增条件参照 Taq DNA Polymerase 试剂盒推荐的方法略有改动。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物, 将符合预期大小的 DNA 片段纯化、回收后连接到 p MD19-T 克隆载体上, 然后转化 DH5 感受态细胞, 蓝白斑筛选后随机挑取 5 个阳性菌落至含有 Amp 抗性的 LB 培养基中振荡培养 1216 h (37, 220 r/min) , 提取质粒 DNA 后送北京奥科生物有限公司测序
25、。1.5 序列分析利用在线程序 Open Reading Frame Finder (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 预测气味结合蛋白基因的开放阅读框, 利用 Primer Premier 5 软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列, Signal P 4.1 Server 在线程序 (http:www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/) 预测蛋白的信号肽, 在线软件 Expasy (http:web.expasy.org/protparam/) 预测蛋白的分子量和等电点, DNAMAN 6.0软件进行多序列比对。在光肩星
26、天牛 OBP12 与其他昆虫 OBPs 的系统发育进化树构建中, 采用 clustalx1.83 进行多序列比对, 利用 MEGA6.0.6 软件并采用最大似然法 (maximum likelihood, ML) (Bootstrap:1 000 次) 构建进化树, 最后使用 Figtree v1.4.0 和 Photoshop CS5 软件对系统进化树进行特殊标记。表 1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this study 下载原表 1.6 光肩星天牛气味结合蛋白基因的表达量分析利用实时荧光定量 PCR 检测光肩星天牛 OBP12 在成虫不同组织的相对表达量
27、, 内参基因为光肩星天牛肌动蛋白基因 Aglaactin1 (登录号:KX660673) , qRT-PCR 所用的引物序列见表 1。反应体系:SYBRPremix Ex Taq (2) 10L, 上下游引物 (10mol/L) 各 0.8L, c DNA 模板 2.0L, DEPC 水补足至20L。利用三步法标准程序进行扩增:95预变性 30 s;95变性 10 s, 60退火 30 s, 72延伸 30 s, 共 40 个循环, 最后在 6095进行熔解曲线分析以排除非特异性 PCR 产物的污染, 每个样品 3 次生物学重复、3 次技术重复。利用 2 法计算 OBP12 在不同组织的相对表
28、达量, OBP12 在成虫不同组织间的表达量差异用单因素方差分析 (Turkeys) 进行检验 (=0.05) , 在雌雄间的表达量差异用独立样本 T 检验 (Independent t-test) 检测 (=0.05) 。1.7 光肩星天牛气味结合蛋白的原核表达及纯化根据光肩星天牛 OBP12 的编码区序列及表达载体 p ET28a (+) 设计带有 Bam H和 Hind酶切位点的引物序列 (表 1) 。以雌虫触角 c DNA 为模板进行 PCR扩增, 将扩增产物纯化回收后连接到 p MD19-T 克隆载体中, 然后转化 DH5 感受态细胞, 经蓝白斑筛选后挑取阳性菌落振荡培养 1216h
29、, 提取质粒 DNA 并测序验证。将含有目的片段的重组克隆质粒 DNA 和 p ET28a (+) 质粒 DNA 分别进行酶切, 在 T4 DNA 连接酶的作用下将目的片段连接到表达载体 p ET28a (+) 上, 再转化到 DH5 感受态细胞中, 用含有卡那霉素的 LB 平板培养基进行筛选, 挑取阳性克隆进行培养, 小量提取质粒后测序验证。将测序验证正确的重组质粒 p ET28a (+) /Agla OBP12 转入大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3) 感受态细胞, 涂板培养后挑取单菌落于 LB 培养液中振荡培养 (37, 220 r/min, 1216 h)
30、, 将小量培养后的菌液按 1100 (v/v) 的比例接种于新鲜的 LB 培养液 (含 Kan 50g/m L) 中, 37, 220 r/min 振荡培养至 OD600=0.60.8 时, 加入终浓度 0.5 mmol/L IPTG 诱导培养 5 h, 然后离心收集菌体, 将菌体重新悬浮后超声波破碎, 12 000 r/min 离心 30 min, 收集上清和沉淀, SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。重组蛋白的变性和复性, 纯化回收, 浓度测定及保存参照 Li 等 (2016b) 的方法进行。1.8 Western-blot 免疫印迹检测利用半干法转膜 (电流 300 m A, 转膜时间
31、60min) 使重组蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至固相载体 PVDF 膜上。首先用封闭液 (TBST 溶解的 5%脱脂奶粉) 对膜封闭 2 h, 然后用 18 000 倍稀释的抗 His 标签鼠单克隆抗体室温封闭 2 h。移弃溶液后用洗脱液 TBST 洗膜 5 次, 然后加入 150 000 倍稀释的羊抗鼠二抗室温反应 1 h, 用 TBST 洗脱液洗膜 5 次, 最后加入免疫印迹化学发光试剂在UVP 凝胶成像系统中显色观察。1.9 荧光竞争结合实验将低温冻存的重组蛋白溶于 20 mmol/L TrisHCl (p H 7.4) 缓冲液至 2mol/L的测试浓度, 荧光探针 1-NPN 和气味标样
32、 (即表 2 中的气味配体) 用色谱级甲醇溶解至 1 mmol/L 的储存液。荧光分光光度计样品池内安装 1 cm 光通径的四通面石英比色杯 (容积 4 m L) , 发射光与激发光狭缝宽度均设为 10 nm, 电压400 V, 激发光波长 337 nm, 扫描发射波长 370550 nm。(1) 测定光肩星天牛气味结合蛋白和 1-NPN 的结合常数。首先移取 2 m L 2mol/L 的蛋白溶液至石英比色杯中, 按 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 和18mol/L 的浓度梯度加入 1-NPN 至蛋白与荧光探针的结合达到饱和, 分别记录每个梯度下产生的最大荧光强度值, 利
33、用荧光值计算蛋白与 1-NPN 的结合常数 (K 1-NPN) 。 (2) 测定 Agla OBP12 与气味配体的结合常数。向比色皿中加入2mol/L Agla OBP12 蛋白溶液和 2mol/L 荧光探针 1-NPN, 在相同条件下记录初始荧光值, 然后将每种气味标样以终浓度 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18 和22mol/L 的梯度 (萜烯类物质的浓度梯度:1, 2, 4, 6, 8, 10 和 12mol/L) 加入到蛋白和 1-NPN 的混合溶液中, 记录荧光强度值。当荧光强度值降低到初始荧光值一半时的配体浓度即为荧光强度中浓度 (IC 50) , 利用公式 Ki=IC
34、50/ (1+1-NPN/K1-NPN) 计算各气味配体的结合常数, 其中1-NPN为未结合的 1-NPN 的浓度, K 1-NPN为 1-NPN 与 Agla OBP12 蛋白的结合常数。2 结果2.1 光肩星天牛气味结合蛋白基因的克隆与序列分析对光肩星天牛雌虫触角转录组测序和基因功能注释获得的 1 种候选 OBP 基因进行克隆, 利用传统 DNA 测序校正了转录组测序和拼接组装中出现的错误碱基, 得到了该基因的完整编码序列, 命名为 Agla OBP12 (Gen Bank 登录号:KX890109) 。Agla OBP12 的开放阅读框 (ORF) 长 414 bp, 编码 137 个氨
35、基酸, 预测分子量为 15.9 k D, 等电点为 4.71, 氨基酸序列的 N-末端有 18 个氨基酸组成的信号肽序列 (图 1) 。图 1 光肩星天牛 Agla OBP12 的核苷酸及氨基酸序列 Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of Agla OBP12 in Anoplophora glabripennis 下载原图预测的信号肽用下划线表示, 6 个保守的半胱氨酸残基用灰色底纹的圆圈表示.The predicted signal peptide sequence is underlined, and six conserved cyst
36、eines are marked by a circle with gray background.2.2 Agla OBP12 多序列比对及系统进化分析Agla OBP12 与天牛科内物种松墨天牛 Monochamus alternatus, 云斑天牛Batocera horsfieldi 以及其他昆虫 Classical OBPs 的多序列比对发现, Agla OBP12 氨基酸序列具有 6 个保守的半胱氨酸残基, 且分布符合 C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4-X8-14-C5-X8-C6 和 C1-X15-39-C2-X3-C3-X21-44-C4-X7-12-C
37、5-X8-C6 (X为除半胱氨酸以外的其他氨基酸) 的特征, Agla OBP12 在序列结构上属于Classical OBPs 亚家族 (图 2) 。通过对 Agla OBP12 序列同源性搜索 (Blast X) 发现, Agla OBP12 与松墨天牛 Malt OBP10 和云斑天牛 Bhor OBP2 的氨基酸序列一致性最高, 分别达 82%和 81%;与榆蓝叶甲 Pyrrhalta aenescens Paen OBP15 和大猿叶甲 Colaphellus bowringi Cbow OBP17 的氨基酸序列一致性也较高, 分别达 57%和 53%, 与已知其他昆虫 OBPs 的
38、氨基酸序列一致性较低, 均小于 50%。将 Agla OBP12 与其他昆虫的 89 种 OBPs 构建系统进化树发现, 所选择的 OBPs 分别聚类到 3 个不同的进化枝, 即“Classical OBPs”, “Minus-C OBPs”和“Plus-C OBPs”进化枝。本实验克隆的 Agla OBP12 与 Bhor OBP3, Darm OBP2, Dhel OBP13, Dpon OBP2, Dpon OBP3, Dpon OBP6, Malt OBP10, Paen OBP15 等 37 种 Classical OBPs 聚类到同一个独立的进化枝, 表明它们之间在进化关系上更加同
39、源 (图 3) 。图 2 Agla OBP12 与其他昆虫 Classical OBPs 的氨基酸序列比对 Fig.2 Amino acid sequences alignment of Agla OBP12 with classical OBPs from other insect species 下载原图星号表示保守位点的半胱氨酸残基 The conserved cysteines are indicated with asterisks.气味结合蛋白来源物种及 Gen Bank 登录号 Origin species of odorant binding proteins and thei
40、r Gen Bank accession numbers:松墨天牛 Monochamus alternatus (Malt OBP10, AIX97025.1) ;云斑天牛 Batocera horsfieldi (Bhor OBP2, AHA33380.1) ;榆蓝叶甲 Pyrrhalta aenescens (Paen OBP15, APC94288.1) ;榆黄叶甲 Pyrrhalta maculicollis (Pmac OBP15, APC94206.1) ;大猿叶甲 Colaphellus bowringi (Cbow OBP17, ALR72505.1) ;华山松大小蠹 Dend
41、roctonus armandi (Darm OBP2, AIY61045.1) ;花绒寄甲Dastarcus helophoroides (Dhel OBP13, AIX97059.1) ;赤拟谷盗 Tribolium castaneum (Tcas OBP24, EFA04747.2) ;黄粉虫 Tenebrio molitor (Tmol OBP2, AJM71476.1) ;日本通草蛉 Chrysoperla nipponensis (Cnip OBP2, AKW47223.1) ;大草岭 Chrysopa pallens (Cpal OBP2, AKW47195.1) ;谷蠹Rhyz
42、opertha dominica (Rdom OBP4, AIX97145.1) ;光肩星天牛 Anoplophora glabripennis (Agla OBP12, KX890109) .2.3 Agla OBP1 2 基因在成虫不同组织的表达量分析为了解 Agla OBP12 基因的可能功能, 利用 qRT-PCR 测定了 Agla OBP12 在雌雄成虫不同组织的 mRNA 转录水平 (图 4) 。结果表明, Agla OBP12 除在雌虫腹部未检测到荧光信号外, 在其他组织均有表达, 但在触角中的表达量最高, 显著高于其他组织。Agla OBP12 在雌虫触角中的表达量分别是头、胸
43、、足和翅部表达量的 555, 87 275, 4 359 和 1 446 倍, 在雄虫触角中的表达量分别是头、胸、腹、足和翅部表达量的 891, 9 484, 6 371, 269 和 942 倍。Agla OBP12 在雌雄虫触角 (P=0.109) 、翅 (P=0.453) 中的表达量差异不显著, 在雌虫头部的表达量显著高于雄虫 (P=0.000) , 在雄虫足中的表达量显著高于雌虫 (P=0.010) 。图 3 Agla OBP12 与其他昆虫 OBPs 的系统进化树构建 Fig.3 Construction of phylogenetic tree of Agla OBP12 and
44、OBPs from other insects 下载原图OBPs 序列的来源物种 Origin species of OBPs sequences:Alin OBP4:苜蓿盲蝽 Adelphocoris lineolatus;Apla GOBP83a-X1, Apla GOBP83a, Apla GOBP72, Apla GOBP19d, Apla GOBP69a, Apla GOBP56d:白蜡窄吉丁 Agrilus planipennis;Atum GOBP72, Atum GOBP19d:小蜂窝甲虫 Aethina tumida;Bhor OBP1, Bhor OBP3:云斑天牛 Bat
45、ocera horsfieldi;Bole GOBP19d-like:橄榄果实蝇 Bactrocera oleae;Bmor GOBP1, Bmor GOBP2, Bmor PBP1, Bmor PBP2, Bmor PBP3:家蚕 Bombyx mori;Cbow OBP1, Cbow OBP2, Cbow OBP4, Cbow OBP5, Cbow OBP13, Cbow OBP17, Cbow OBP18, Cbow OBP20, Cbow OBP22, Cbow OBP23, Cbow OBP25:大猿叶甲 Colaphellus bowringi;Cnip OBP11:日本通草蛉Ch
46、rysoperla nipponensis;Cpal OBP11:大草蛉 Chrysopa pallens;Darm OBP2, Darm OBP3, Darm OBP7:华山松大小蠹 Dendroctonus armandi;Dhel OBP13:花绒寄甲 Dastarcus helophoroides;Dhou OBP:云南松毛虫 Dendrolimus houi;Dkik OBP:思茅松毛虫 Dendrolimus kikuchii;Dpon OBP1, Dpon OBP2, Dpon OBP3, Dpon OBP6, Dpon OBP9, Dpon OBP16, Dpon OBP17,
47、 Dpon OBP19, Dpon OBP26, Dpon OBP28:山松大小蠹 Dendroctonus ponderosae;Harm GOBP1, Harm GOBP2, Harm PBP1, Harm PBP2, Harm PBP3:棉铃虫 Helicoverpa armigera;Hpar OBP5, Hpar OBP16, Hpar OBP18, Hpar OBP29:暗黑鳃金龟Holotrichia parallela;Lory OBP:稻水象甲 Lissorhoptrus oryzophilus;Lstr OBP, Lstr OBP8, Lstr OBP9:灰飞虱 Laode
48、lphax striatellus;Malt OBP4, Malt OBP5, Malt OBP10:松墨天牛 Monochamus alternatus;Nves GOBP72, Nves GOBP lush-like, Nves GOBP56d, Nves GOBP99a, Nves GOBP56a:大红埋葬甲 Nicrophorus vespilloides;Paen OBP15:榆蓝叶甲 Pyrrhalta aenescens;Rdom OBP3, Rdom OBP7, Rdom OBP8, Rdom OBP11:谷蠹 Rhizopertha dominica;Rapl OBP2, R
49、apl OBP4:棕榈象甲Rhynchophorus palmarum;Sexi OBP9:甜菜夜蛾 Spodoptera exigua;Sfur OBP4, Sfur OBP9:白背飞虱 Sogatella furcifera;Tcas OBP4, Tcas OBPC20, Tcas OBP25:赤拟谷盗 Tribolium castaneum;Tmol OBP11, Tmol OBP14, Tmol OBP15, Tmol GOBP83a, Tmol GOBP56-like, Tmol GOBP72, Tmol GOBP19d:黄粉虫Tenebrio molitor.采用最大似然法 (Bootstrap:1 000 次) 构建进化树。Phylogenetic tree was constructed by maximum likelihood (ML) method (bootstrap:1 000) .2.4 重组蛋白 Agla OBP12 的表达及纯化从图 5 (A) 可以看出, 重组表达质粒 p ET28a (+) /Agla OBP12 转入感受态细胞 BL21 (DE3) 后在 I
