1、实验十八 外 源 基因 在 大 肠 杆 菌 中的 高 效 表 达 一、实 验目的 1.掌握外源基因在大 肠杆菌中表达的特点和方法。2.复习 SDS-PAGE 的 制备及其分离原理。二、实 验原理 一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子 5 端大约 9bp 的 SD 序 列；位于目的基因 3 末端的一个高效转录终止子。此 外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。E.coli 表达载体的基本结构见下图：1 有效的转录起始与基因的高效表达 有效的转录起始是外
2、源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键性步骤之一。最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起的细胞死亡等问题。对于原核细胞而言，可分为可诱导型启动子，比如 lac，trp，tac，phoA 等，和 组成型启动子如 T7 噬 菌体启动子。2 mRNA 的有效延伸和转录终止与基因的高效表达 转录开始后，mRNA 开 始 进 行 有 效延 伸，终止 以 及 稳 定 的积 累，在这 个 过程中，转录物内的衰减和非特异性终止能诱发转录中的 mRNA 分子提前终止。衰减子位点具有简单终止子的特性，在原核细胞
3、中 其处于操纵子的启动子和第一个结构基因之间，为保证 mRNA 转录安全，在表达载体的组建中要尽量避免其存在。正常的转录终止子序列的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是防止不必要的转录，使 mRNA 的长度限制到最小，增 加表达质粒的稳定性。对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和 poly A 加入位 点，使外源基因高效表达的重要因素。3 有效的翻译起始与基因的高效表达 在原核细胞中使翻译起始达到最大效率的一般原则：1)AUG(ATG)是 最首选的起始密码子。GUG、UUG、AUU 和 AUA 有时也用作起始密码子，但非最佳选择。2)SD 序列中至 少含有 AGGAGG 序列
4、中的四个碱基。3)SD 与起始密码之间的距离以 9 3 为 适宜。4)在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件易被核糖体识别和结合。5)通过突变 mRNA 5 非翻译区的核苷酸序列，减少、去除某些 stem-loop 结构可以提高翻译的起始效率。4 遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达 由于核糖体对遗传密码具有选择性，翻译的速度不是恒速的。高表达的基因经常使用所谓的偏倚性密码。大肠杆菌及其所有的生物的 mRNA 中都含主密码子（偏倚密码）和罕用密码子，关联 tRNA 的 水平是与相应的密码子的使用频率成正比的。如果从克隆来的基因含有罕用密码子或其氨基酸组成的分布偏离典型
5、大肠杆菌的氨基酸分布组成，那么外源基因在表达过程中，由于没有足够的与之相适应的 tRNA，其蛋白质合成的质和量都受到影响。5 mRNA 序列上终止 密码的选择 在大肠杆菌中合成的多肽链的释放由两个释放因子所调控，RF1 识别 UAA和 UAG，而 RF2 识别 UAA 和 UGA。而在真 核细胞中也有两个释放因子 eRF。三个终止密码在终止效率上是不同的，其中 UAA 在基因高水平表达 中终止效率最好。在原核细胞中，由于 UAA 为两个释放 因子所识别，因此在基因合成中，一般采用 UAA 作为终 止码。在实际的操作中，为了保证翻译的有效终止，采用串联的终止密码，而不是一个终止密码。6 外源蛋白
6、的稳定性与基因的高效表达 外源蛋白 质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解 酶所降解，这是基因高效表达的一个重要参数。避免外源蛋白被选择性 降解，可采用以下几种方式：1）融合 蛋白的载体部分通过 构 象的改变，使外源蛋 白 不被选择性降解。2）产生可分泌 的蛋白，如外源基因 表 达产物可以分泌到大 肠 杆菌的周质或者直接分泌到培养基中。3）外源蛋白可以在 宿主细胞中以包含体的形式表达，这种不溶的沉淀复合 物 可以抵抗宿主细胞中 蛋 白水解酶的降解，以 便 纯化。4）选择合适的受体表达系统，如选择蛋白水解酶基因缺陷型菌株。受体细胞的选择是保证外源基因有效表达的最重要的 因素之一。常
7、用表达载体 具有以下几种元件：1.可控转录的启动子；类型：Plac，Ptac，PT7，PT5，etc 2.转录调控序列（转录终止子，核糖体结合位点）；3.一个多克隆限制酶切位点；4.选择标志的编码序列；类型：AmpR，KanR，etc 5.宿主体内自主复制的序列。融合表达蛋白标签：GST，6xHis，MBP，GFP，etc pGEX 系列（tac promoter,GST 融合表达）pET 系列（T7 promoter,6 His）pQE 系列（T5 promoter,6 His）常用宿主菌种类 1、BL21(DE3)pLysS（蛋白酶缺陷型）自身表达 T7 RNA polymerase,适用
8、 pET 系列等带 T7 启 动子的载体 2、M15/SG13009：自 身表达 T5 RNA polymerase,适用 pQE 系列等带 T5 启 动子的载体 诱导条件（可根据具体实 验情况调整）：1.IPTG 浓度,0.1mM-1mM。IPTG（异丙基-D-1-硫代半乳糖苷)是乳 糖的类似物；不被细菌分解,性质稳定；能在缺乏 lacY 基因下而有效地被运送。2.诱导温度,20oC-37oC 3.诱导时间，2 小时-20 小时 大肠杆菌表达的一般流程：获得目的基因 准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导外源蛋白的表达 表达蛋白的分析 扩增、纯化、进一步检测。大
9、肠杆 菌表达 体系 优点：1.基因表达调控的分 子机制清楚；2.使用安全，有多种 适用的寄主菌株和载体；3.多数克隆的外源基 因都可高效表达；4.培养方便、操作简 单、成本低，易于批量生产。不足：在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少糖基化、磷酸化等翻译后加 工，且常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。三、实 验 材料与设备 器材：恒温摇床，各种量程移液器，电泳仪，蛋白电泳槽等 试剂：LB 培养基，IPTG 贮存液 100 mM，10 SDS-PAGE 凝胶，上 样缓冲液，电泳缓冲液，染色液，脱色液等 四、实 验步骤 1.目的蛋白的诱导及表达（1）含外源基因 GFP 的表达菌株在 LB 培养
10、基（含 100 g/mL Amp）中 37oC下预培养过夜；（2）按 1/10 的比例稀 释菌液（在 4.5 mL 新鲜 LB 培养基中加入 500 L 过夜菌液),于 250 r/min，在 37 oC 下培养 1 小时,使其 OD600 值达到 0.4-0.7；（3）（两人一组）取 5 mL 菌液，分装于两个 试管中（1.0 mL 和 4.0 mL）：在4.0 mL 菌液中加入 8L 100 mM 的 IPTG，使其终浓度为 0.2 mM，进行 GFP蛋白的诱导；1.0 mL 菌液，不加 IPTG 做为 未诱导负对照。在 37 下继续培养3 小时；（4）分别取 1.0 mL 诱 导及未诱导
11、菌液于 3500 r/min，离心 5min，弃上清；（5）在菌体中加入 30 L 裂解液，煮沸 5 min,于 3500 r/min，离心 5 min,取15 L 上清液上样到 10%SDS-PAGE 凝胶。2.目的蛋白的检测（1）制备 10%SDS-PAGE 凝胶（共需配制 4 块 15 个样孔胶）（2）凝胶电泳 将电泳缓冲液分别注入负极电泳槽和正极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80 V 恒压 20 分钟，120 V 恒压 1 小时。（3）染色、脱色 电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色 5 分钟；之后，在脱色液中脱色 0.5-1 小时，观察目的蛋白表达情况。五、结 果与分析
12、 在染色后的 凝胶上观察目的蛋白表达情况，注意比较诱导与未诱导的样品中蛋白条带的差异，确定诱导表达蛋白的 大小。六、思 考题 1.在大肠杆菌中表达 外源基因时需要考虑哪些因素？2.在诱导表达外源基 因时加入 IPTG 的作用 原理？实验安排：1、两人一组，离心时两人共两个离心管（诱导及未诱导的样品）2、上样时每组上两个样品（诱导及未诱导的样品）（每次课共需 15 孔胶 4 块，电泳槽两个）注：SDS-PAGE 胶 由同 学自行 配制，在 等待 诱导 表达 3 小 时里，配制 4 块 10%凝胶。成分 配制不 同体 积 分离胶 所需 各成分 的体 积（毫升）10%胶 5 10 15 20 30
13、50 蒸馏水 1.3 2.7 4.0 5.3 8.0 13.3 30%Acr-Bis（29:1）1.7 3.3 5.0 6.7 10.0 16.7 1M Tris，pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过 硫酸 铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 成分 配制不 同体 积 浓缩胶 所需 各成分 的体 积（毫升）5%胶 2 3 4 6 8 10 蒸馏水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.8 30%Acr-Bis（29:1）0.33 0.5 0.67 1.0 1.3 1.7 1M Tris，pH 8.8 0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.25 10%SDS 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 10%过 硫酸 铵 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01
