1、九江苦荞的组织培养及卡那霉素浓度的筛选 摘要：本试验以九江苦荞为研究材料，下胚轴为外植体，MS为基本培养基，建立组织培养再生体系。通过添加不同浓度的生长素和细胞分裂素，设计不同激素配比组合，相同的培养条件下，研究九江苦荞下胚轴愈伤组织诱导和分化，筛选出诱导九江苦荞愈伤组织和芽分化的最适培养基，为基因工程提供参考。并在不同卡那霉素浓度条件下，研究对愈伤组织和芽分化生长的影响，为农杆菌介导转化的研究奠定基础，为基因工程改良荞麦芦丁生物合成提供了理论依据及技术保证。研究表明：下胚轴诱导愈伤组织的最适培养基为MS+2，4-D 3mg/L+6-BA 0.1mg/L，芽分化和生长的最适培养基为MS+6-B
2、A 3mg/L+IBA 0.5mg/L。荞麦对卡那霉素反应较为敏感，卡那霉素浓度高于25mg/L，可抑制愈伤组织形成芽。 关键词：荞麦；愈伤组织；卡那霉素 荞麦（Fagopyrum esculentum）是蓼科荞麦属的双子叶植物，主要栽培种有甜养和苦养2种。中国是荞麦生产大国，出口量占第一位，总产量居世界第二。不仅具有食用价值，而且具有一定的药用价值和生物学价值。 苦荞是一种优良的黄酮类化合物。据文献报道，荞麦子叶中的总黄酮含量高达6.16%，黄酮具有很强的抗氧化性和清除自由基功能，还是生产芦丁的重要原料。其药理和化学成分研究表明：荞麦中的类黄酮物质芦丁对高血压、糖尿病、心血管疾病等具有良好的
3、治疗效果。 荞麦生理生化和分子生物学上已有一定的研究并取得成功，主要技术是杂交、多倍体和诱变育种。近年来，对荞麦主要致力于它的化学组成，关于荞麦组织培养的研究报道较少。 卡那霉素是氨基糖苷类抗生素，转基因试验中，常作为区分转基因植物细胞与非转基因植物细胞的标记。它作为一个广泛使用的选择剂，在对于转化研究、提高作物产量、拓展药源微生物菌株资源，以及在选育环境治理优良菌株等领域也具有巨大的潜在应用前景。 本试验目的是获得九江苦荞的再生体系，并且筛选出能够促使荞麦愈伤组织芽分化的最低卡那霉素浓度，为农杆菌介导和遗传转化提供参考。 1 材料和方法 1.1外植体材料 挑选由山西省农科院研究所提供的九江苦
4、荞种子，选取籽粒饱满的成熟种子，用75%酒精处理1min，漂洗45次，再用0.1%升汞处理8min，漂洗45次，将灭菌后的种子接种到附加3%蔗糖、0.75%琼脂粉无激素的MS培养基中，在温度25，日照时数12h条件下培养45天，获得无菌苗。选取无菌苗的下胚轴作为外植体试验材料。 1.2试验用培养基 基本培养基为MS培养基。 1.3试验试剂 卡那霉素浓度的筛选中，选用的剂量分别为0mg/L、15mg/L、25mg/L、35mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L。 1.4方法 九江苦荞下胚轴愈伤组织的诱导，分别取生长515d的九江苦荞无菌苗的下胚轴在75%的乙醇中浸泡1min，蒸馏水
5、漂洗45次，0.1%升汞溶液消毒8min，蒸馏水漂洗45次，无菌环境中将下胚轴切为约0.5cm0.5cm的切块，接种于不同激素配比的MS培养基上（表1），温度25，湿度75%的条件下暗培养1周并观察记录愈伤情况。诱导出的愈伤组织分别接种于已经设置好的不同培养基中（表2），培养在相同环境中，并观察记录分化情况。 1.5数据分析 试验数据在Excel2003软件中进行初步的录入和处理，计算平均值和标准差，并进一步生成图表。处理间（不同激素配比）的差异显著性在SPSS 15.0软件中采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，统计显著性P=0.05。 2 结果与分析 2.1九江苦荞下胚轴再生体系的建立
6、 2.1.1激素配比对九江苦荞下胚轴愈伤组织的诱导。愈伤组织诱导过程（激素配比见表1），暗培养1周后再转至光下，2周后形成完整的愈伤组织，随着2，4-D浓度升高而明显膨大，颜色多为红色和黄绿色，当浓度为4mg/L时整个愈伤组织变为水渍状，随着浓度升高而褐变（表3）。 由表3可知：九江苦荞下胚轴在MS+2，4-D 3mg/L+6-BA 0.1mg/L培养基中，愈伤组织为绿白色，致密，愈伤率为92%，为最适培养基，在诱导愈伤组织过程中，2，4-D浓度过高，愈伤组织易发生水渍状，褐化；浓度过低，愈伤组织生长缓慢，不利于分化。 2.1.2不定芽的分化。九江苦荞由下胚轴诱导出的愈伤组织，将其切为0.5c
7、m0.5cm的切块，接种于不同的培养基中（激素配比见表2），诱导不定芽的产生（表4）。通常在培养基中添加细胞分裂素6-BA和生长素IBA等，可获得再生植株。 表4可知：适当浓度的细胞分裂素和生长素的配比，可提高芽的分化率，下胚轴外植体所诱导的愈伤组织均在MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L的培养基组合上，分化率最高为26.9%，但伴有玻璃化现象。 2.2根的诱导 当苗长到23cm高时，将2种外植体材料经过愈伤组织的诱导进而分化出的不定芽由MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.1mg/L和MS+6-BA 3mg/L+IBA0.5mg/L的培养基中转接至无激素添加的MS培养基中，诱
8、导其生根，生根率达90.9%。 2.3卡那霉素浓度的筛选 本试验选用九江苦荞下胚轴所诱导的愈伤组织和不定芽为试验材料，卡那霉素筛选剂量分别为0mg/L、15mg/L、25mg/L、35mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L附加在6-BA 1.5mg/L+IBA 0.3mg/L的培养基中（见表5）。 由表5看出，随着Km浓度增加，死亡频率明显增加，大部分颜色为绿色，但是分化率很低，仅为2.21%，说明外植体对高浓度Km的耐性较低，Km浓度为15mg/L时，接种10天左右，产生愈伤组织，但是分化频率极低，不定芽生长良好，Km浓度为25mg/L时，接种10天左右，愈伤组织颜色为白绿色，
9、生长良好，分化频率进一步降低。当Km浓度为35mg/L时，愈伤组织和不定芽仍然生长良好，浓度为50mg/L和75mg/L时，接种1个月以后，分化率为0，不定芽有死亡现象，浓度达到100mg/L时，部分褐化和死亡。所以，Km浓度高于35mg/L时，抑制了荞麦愈伤组织芽分化和生长。而低浓度的Km（25mg/L），有不同程度的芽分化抑制作用。 3 讨论 3.1愈伤组织诱导 愈伤组织的诱导是应用细胞全能性原理，通过诱导愈伤组织发生和芽的分化而获得再生植株，愈伤组织的诱导与培养基、外植体、光照、外源激素等都有一定影响。光照：光暗培养有利于愈伤组织各种蛋白、核酸物质的积累。外源激素：加入过高或者过低的2，
10、4-D和IBA会生长不良，水渍状甚至褐化。而本试验中采用2，4-D和IBA 2种激素获得了良好的诱导效果，生长素与细胞分裂素的比值决定了有利于根或芽的分化，比值适中时可维持原组织生长而不分化。 3.2不定芽诱导 植物组织培养研究表明，细胞分裂素有利于芽的分化和增殖。芽的分化与激素配比有关。细胞分裂素浓度高时，利于形成芽，细胞分裂素浓度低时，利于形成根。MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L诱导出的芽分化率最高，但是有玻璃化现象，芽翠绿透明、脆弱，生长缓慢，部分失绿。这些与生长调节剂、温湿度、消毒时间、光照等都有重要关系，降低玻璃化现象的发生：必须控制在8min，避免诱导和分化过程中
11、易褐化或者出现玻璃化。在培养过程中芽分化时适当降低IBA浓度，高浓度细胞分裂素有利于促进芽分化，但也会使玻璃化苗发生的比例提高。控制温度和湿度，温度升至30左右，愈伤组织含水量增加，也会引起玻璃化的现象。光照：加强光照，延长光照时间，调节激素配比来降低玻璃化现象的发生。 3.3卡那霉素的筛选 筛选过程中，卡那霉素浓度增加，植株受损严重，不附加卡纳霉素的培养基中，植株生长正常，随着卡那霉素浓度升高，器官会出现停止生长，褐变甚至死亡现象。结果表明：浓度过低，不会影响芽分化的形成；浓度过高，尽管未观察到大量愈伤组织和不定芽死亡，但严重地抑制了芽的分化和生长。我们将通过农杆菌侵染愈伤组织，以便进一步挑
12、选适合筛选的卡那霉素浓度。 4 存在的问题 荞麦获得再生植株的频率较低，且分化率较低。目前荞麦品种极度退化，严重影响其产量和品质的进一步提高，所以，建立荞麦再生体系这一研究具有可行性。培养过程中的一些问题（如褐化、不定芽增值过程中出现脱叶现象，玻璃化再生苗），是卡那霉素筛选体系不够完善，针对这些问题还有待于进一步解决和改进。 5 结论 （1）九江苦荞下胚轴诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2，4-D 3mg/L+6-BA 0.1mg/L，诱导芽的最佳培养基为MS+6-BA 3mg/L+IBA0.5mg/L。 （2）荞麦对卡那霉素反应较为敏感，低于25mg/L的卡那霉素，对愈伤组织芽分化和生长有不同程度的抑制作用。卡那霉素的筛选为进一步的遗传转化提供了基础。第 7 页 共 7 页
