1、CD73 对骨髓间充质干细胞增殖与衰老的影响 王琰 李琼 张三林 郭志坤 新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室 中国人民解放军第 371 医院心血管内科 摘 要： 目的 探讨 CD73 对骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 增殖与衰老的影响。方法 培养小鼠 BMSCs, 构建慢病毒 CD73 过表达载体和 CD73 RNAi 干扰载体, 分别转染BMSCs, 实验分组:CD73 过表达组 (OE 组) 、CD73RNAi 干扰组 (RNAi 组) 和对照组 (CON 组) 。衰老相关 -半乳糖苷酶 (SA-Gal) 染色检测细胞的衰老情况;MTT 法检测细胞增殖能力变化;流式细胞术检测细胞周期
2、变化;透射电子显微镜观测转染后细胞的超微结构;非损伤细胞功能分析仪检测细胞生长曲线。结果 慢病毒转染 BMSCs 后 72 h 和 168 h, 衰老细胞数量 RNAi 组CON 组OE 组 (P0.05) 。转染第 1 天, GFP 未表达, 细胞增殖约为转染前 0.5 倍;转染第 2 天 GFP 较弱, 细胞增殖速率达顶峰;转染第 34 天 GFP 表达最强, 各组增殖能力显示 OE 组CON 组RNAi 组 (PCON 组OE 组, 且差异具有统计学意义 (P0.05) 。2.CD73 转染对 BMSCs 的细胞周期影响第 3 代 BMSCs 过表达或干扰 CD73 后, OE、RNAi
3、 和 CON 细胞周期变化结果如下:G1期细胞所占比例分别为 25.9%、44.1%和 51.7%;S 期细胞所占比例分别为48.8%、30.9%和 26.9%;G2期细胞所占比例分别为 25.2%、25.0%和 21.4% (图 5;表 1) 。3.CD73 转染 BMSCs 的亚微结构第 3 代 BMSCs OE 组转染后的电子显微镜观察显示, 细胞形态不规则, 呈现长短不等的突起, 细胞膜表面不光滑, 有微突。细胞质内粗面内质网丰富, 内质网腔扩张, 核糖体增多, 个别线粒体肿胀, 脱嵴, 偶见线粒体髓样变 (图 6A) ;RNAi 组可见细胞核大, 不规则, 出现折叠, 偶见核仁, 可
4、见较多粗面内质网, 少量线粒体, 胞膜不光滑, 可见指状突起 (图 6B) 。4.转染 CD73 后 BMSCs 生长曲线变化非损伤细胞功能分析仪记录各组细胞生长曲线显示, 各组细胞生长曲线标准化 (以转染时间为起点) 后可见 CD73-OE 组细胞生长指数高于 CD73-NC 组和 CD73-RNAi 组 (图 7) 。图 2 P3 BMSCs 过表达或干扰 CD73 后不同时间细胞增殖能力变化, MTT 法;#表示差异有统计学意义 (P0.05) Fig.2 Cell proliferation ability of P3 BMSC at different time after over
5、expression or interference with CD73, MTT assay;#indicates that the difference was statistically significant (P0.05) 表 1 P3 BMSCs 过表达或干扰 CD73 后 72h 各组细胞周期情况 Table 1 Cell cycle in each group of P3 BMSCs overexpression or interference CD73 after 72 hours 下载原表 讨论CD73 广泛分布于人体各种组织和细胞表面, 可催化 5-磷酸腺苷水解为腺苷,
6、通过腺苷与腺苷受体作用发挥一系列生物学作用。MSCs 具有自我更新能力, 但在体外培养时, 随着培养代次增加、时间延长, 衰老不可避免7。有研究表明, CD73MSCs 是心肌修复的优势亚群4, CD73 在肿瘤组织中过表达且可促进肿瘤细胞增殖3, 在肿瘤发生发展中, CD73 促进内皮细胞形成新的血管8, 可能与肿瘤的快速增长和转移有关。CD73 作为 MSCs 的表面标记, 其对 MSCs 的增殖和衰老有否影响?目前文献鲜有报道。本研究通过 MTT 实验表明在转染前及转染后 12d, 各组增殖速度无差异, 转染第 34 天, 病毒发挥作用, OE 组细胞数量高于 RNAi 组及 CON 组
7、;流式细胞术观察 CD73 过表达时 MSCs 细胞周期情况, OE 组和 NC 组 G1期细胞所占比例分别为 25.9%和 51.7%, S 期细胞所占比例分别为 48.8%和 26.9%, G2期细胞所占比例分别 25.2%和 21.4%, 由此可表明, MSCs 过表达 CD73 后, G 1期细胞比例减少, G 2和 S 期细胞比例增加, 证实了 CD73 具有促增殖的作用。CD73 转染后的超微结构, 目前国内外文献中鲜有报道, 本实验从超微结构上观察 MSCs 过表达CD73 后, 粗面内质网丰富, 内质网腔扩张, 核糖体增多, 可能提示 CD73 可能对于增加细胞蛋白质合成, 增
8、强细胞的分泌功能起重要作用。少数线粒体髓样变, 个别线粒体肿胀、脱嵴, 可能是在制片过程中人为因素所致并非细胞病理变化。RNAi 组的细胞亚微结构与过表达组相比, 在形态上差异不大, 提示 CD73可能对细胞的形态结构影响不明显。通过计算细胞衰老总数及细胞衰老孔数之比证明, OE 组均少于 RNAi 组和 CON 组, 说明 CD73 在抑制细胞衰老过程中发挥了重要作用。图 1 P3 BMSCs 转染慢病毒后各组 GFP 荧光表达效果, 荧光倒置显微镜标尺示100mFig.1 Fluorescent expression of GFP in P3 BMSCs transfected with
9、lentivirus, fluorescence inverted Bar=100m图 3 P3 BMSC 72 h (A, B, C) 和 168 h (D, E, F) 过表达或干扰 CD73 后 72 h 时细胞衰老情况, SA-Gal 染色, 标蓝染细胞为衰老细胞标尺示200mFig.3 Cell senescence at 72hours (A, B, C) and 168 h (D, E, F) after P3BMSC overexpression or interference with CD73, SA-Gal staining Bar=200mshowing blue-st
10、ained cells for senescent cells图 4 BMSCs 过表达或干扰 CD73 72h (A) 和 168h (B) 后平均每孔衰老细胞数量变化#表示差异有统计学意义 (P0.05) Fig.4 The average number of aging cells per hole changes of BMSCs overexpression or interference with CD73 after 72h (A) and 168h (B) #indicates that the difference was statistically significant
11、(P0.05) 图 5 P3 BMSCs 过表达或干扰 CD73 后 72 h 各组细胞周期情况流式细胞术 Fig.5 Cell cycle of P3 BMSCs overexpressing or interfering with CD73 at 72 hours Flow cytometry 下载原图图 7 P3 BMSCs 过表达或干扰 CD73 后 72h 各组细胞生长曲线 Fig.7 Cell growth curve of P3 MSCs after overexpression or interference with CD73 for 72 hours 下载原图CD73 对
12、MSCs 的促增殖、延缓衰老作用机制目前尚不清楚。Bavaresco 等5发现, CD73 可促使胶质细胞瘤的增殖, Gao 等9的研究表明, CD73 可促使人宫颈癌细胞 He La 和 Si Ha 的增殖, 且这种增殖作用不能被 CD73 的抑制剂 APCP (100mol/L) 减弱, 该研究发现了 He La 和 Si Ha 细胞高表达 CD73 会增强EGFR/Akt 和 VEGF/Akt 通路蛋白表达, 且 CD73 促细胞增殖作用与酶活性无关。Zhi 等10在乳腺癌研究中发现, CD73 促进 EGFR 表达可能是通过一些相关转录因子 PPAR 等的调控作用来实现。CD73 在体
13、内有多种生物学功能, 如调控组织屏障功能11, 参与上皮细胞水电离子转运12, 介导促炎和抗炎效应13, 参与免疫逃避及免疫抑制14, 限制纤维化的发展15, 促使细胞分化, 促血管再生等作用, 由 CD73 介导的腺苷, 在临床上已被适用于心脏、血管、神经、视觉、肿瘤等方面治疗, CD73 也作为临床辅助检查指标。在临床上应用 MSCs 移植治疗心肌梗死时, 随着时间增加, 细胞衰老会影响移植效果。本研究结果显示, CD73 的促进细胞增殖和抑制细胞衰老的作用, 可以增强 MSCs 的活性, 延长生存时间, 对于提高治疗效果具有重要意义。但是, 在移植 CD73MSCs 优势亚群治疗心肌梗死
14、时, 必须考虑 CD73 促增殖作用可能引起的以下问题:修复损伤心肌过程中, CD73 促进移植 MSCs 增殖的同时, 是否会同时导致心肌、成纤维细胞等的增殖, 在加速心肌修复过程中, 可能产生心脏局部过度增生, 甚至导致房室传导阻滞、心肌收缩力下降、心律失常等问题。如何平衡 CD73 促进 MSCs 增殖、抑制 MSCs 衰老和可能出现的副作用的关系尚需进一步深入研究。参考文献1Rosi F, Carlucci F, Marinello E, et al.Ecto-5-nucleotidase in Bcell chronic lymphocytic leukemiaJ.Biomed Ph
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