1、不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析 摘要为探讨不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的差异，采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义3个产地杜仲皮内生真菌，通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定，共分离得到152株内生真菌，分属于8个属，其中Phomopsis，Diaporthe，Alternaria为3个产地内生真菌共有属，各产地的优势种群不同。相似性分析表明，不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异；多样性及均匀度分析表明，慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高，分布较均匀。遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数最低，优势种群集中，奇异度较高。拟茎点菌属与其有性
2、态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析，不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富。综合分析认为，杜仲皮组织的内生真菌具有多样性，慈利、遵义和略阳3个产地内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异。 关键词杜仲皮；产地；内生真菌；ITS；多样性 收稿日期2013-07-31 基金项目国家科技支撑计划项目（2011BAI01B08）；湖南省自然科学基金项目（14JJ4069）；湖南中医药大学研究生创新课题项目（2012CX04） 通信作者*张水寒，教授，博士生导师，研究方向为中药资源、中药制剂及质量标准，Tel：（0731）88881651， E-mail： 杜仲Eucommia ulmo
3、ides Oli是杜仲科单属植物，为我国特有的经济树种，同时又是名贵的滋补药材。传统杜仲以树皮入药，药材的中心产区在湘西北、黔北、黔西及陕南等地1 。不同产地杜仲药材的品质有差异，据文献初步研究报道，外部环境因子如产地气候2、土壤3等可能是造成产地差异性的因素。近年来，关于杜仲内生真菌的研究逐渐引起了人们的重视，相关研究表明，杜仲内生真菌对多种病原真菌都有抑菌活性4，且从多种杜仲内生真菌发酵提取物中检测到与宿主相同的药效物质成分，如松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸5-7等，这些成分是评价杜仲药材质量的重要指标8。可见，杜仲内生真菌作为构成植物内环境的重要组分，对杜仲植物生长、其次生代谢产物积累及药材品
4、质等均具有较大的影响。由于同一种植物生长在不同的环境，其内生菌的多样性及生物活性都有所不同9-10，本实验拟从杜仲内生真菌的角度，研究不同主产区的树皮内生真菌的种群结构的差异，分析差异产生的原因，以期为寻找内生真菌与外部环境的相关性提供一定的线索，也为内生真菌与不同产地杜仲药材品质差异的相关性研究奠定基础。 1材料 1.1样品采集2012年11月，分别在杜仲主产区：贵州遵义枫香镇、湖南慈利江垭林场、陕西略阳县天台村随机选取5棵78年生健康的杜仲树，在离地11.5 m高处，剥取新鲜干皮后置于无菌保鲜袋中，并于4 保存备用。 1.2培养基11内生菌分离、纯化及菌种保藏均采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA
5、）培养基，液体发酵培养基采用马铃薯葡萄糖（PD）培养基。 1.3主要仪器与试剂SW-CJ-2D型净化工作台（苏州净化）、THA-3560C高压蒸汽灭菌锅（造鑫企业有限公司）、ZSD-1270型生化培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；QHZ-98B全温光照振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）；Motic BA-400数码成像光学显微镜（武汉麦克奥迪仪器仪表有限公司）。 琼脂粉（福建泉州市泉港化工厂，批号 2009002）、葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，批号F20111208）、次氯酸钠溶液（广东光华科技股份有限公司，批号 20120203）；CTAB，-巯基乙醇，Tris，冰醋酸，氯化钠（
6、均为国产试剂）；自制超纯水。 2方法 2.1内生真菌的分离、纯化及保藏11-12取3个产地的杜仲皮适量，先用水冲洗外表至干净，滤纸吸干表面的水分。用无菌刀将样品切割成约3 cm3 cm的小块，在75%乙醇溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗样品表面3次，无菌滤纸吸干；再用5.5%次氯酸钠溶液浸泡3 min后，用无菌水冲洗样品表面5次，无菌滤纸吸干。用镊子及解剖刀刮去栓皮层，取其中心韧皮部约0.4 cm2的小块，贴于PDA培养基的表面，每皿放2块材料，于28 恒温培养箱内培养310 d。待菌丝从植物组织长出后，及时从边缘挑取菌丝移至新的PDA平板上，采用菌丝顶端纯化法对分离出的菌种逐步进行纯化。纯
7、化后的菌种接种于PDA斜面试管上，并放4 保存。把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于PDA平板上，作为漂洗检验对照；将上述表面灭菌处理的组织块贴于PDA平板上，使其与培养基接触20 min后，移去植物材料，作为组织印记对照，于相同条件下培养、观察，以确保表面灭菌彻底，分离出的为内生菌。 2.2形态鉴定按照真菌经典分类方法，平板培养之后观察菌落特征，及菌种孢子的显微形态，依据真菌的形态分类学原理13进行鉴定。 2.3分子鉴定从固体平板上挑取少量菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28 ，150 rmin-1摇床培养35 d后 ，抽滤收集菌丝体。菌丝体先用无菌水冲洗3 遍，将洗涤后的菌丝体用冻干机冻干
8、备用。采用CTAB法提取内生真菌基因组DNA。采用在真菌ITS测序通用引物ITS4/ITS5进行PCR扩增： ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）（由上海生工生物工程有限公司合成）。扩增体系为50 L 反应体系，其中10PCR 缓冲液（含Mg2+） 5 L， 10 mmolL-1 dNTP 0.5 L，25 UL-1Taq DNA 酶0.5 L，正反向引物（10 molL-1 ITS4 和ITS5）各1.25 L，DNA 模板1 L，ddH2O 40.5 L。PCR 反应程序：预变性94 ，4 min，变
9、性94 ，40 s，复性54 ，40 s，延伸72 ，50 s，33个循环，后延伸72 ，8 min。反应结束后得到的PCR 产物，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR 反应产物纯化后送上海生工生物科技有限公司进行测序。 根据测序结果，在GenBank数据库中进行BLAST比对，搜索同源序列。尽量选取同源性较高的菌株序列与所测代表性序列采用Clustal X 1.81进行多重序列对比，再利用MEGA 5.1软件进行系统发育分析，并以自展法（bootstrap）进行检测，共循环1 000次，构建邻接树。同时，采用Kimura 2-parameter model对同属的序列构建遗传距离矩阵。 2.
10、4内生真菌多样性及相似性分析14-15分离频率是指某类真菌的总菌株数除以分离所得的所有菌株总数，即某种真菌占所有菌株的百分率。 从属的层面上来看不同产地的内生真菌多样性指数，计算方法如下。 Shannon-wiener多样性指数（H）：H =-Ni/N lnNi/Ni（其中Ni是指某种内生真菌的数目，N指内生真菌的总数目）； Pielou均匀度指数（E）：E= H/lnS （其中S指群落中内生真菌的总种类数）； Simpson指数（D）：D=1-（Ni/N）2。 根据Sorenson系数公式计算，相似性系数Cs=2j/（a+b），其中，j是2个部位共同具有的内生真菌种类数，a是一部位内生真菌的
11、种类数，b是另一部位内生真菌的种类数，相似性系数可以比较不同部位之间内生真菌种类组成的相似程度。 3结果与分析 3.1不同产地内生真菌的分布情况从3个产地83个杜仲皮组织块中共分离出152株内生真菌，分属于8个属，其中拟茎点菌属、间座壳属、链格孢属为3个产地内生真菌共有属，且为优势菌群。从不同产地分离到的内生真菌又有数量上的差异，慈利产地的杜仲皮内生真菌种群以链格孢属占优势，略阳产地的杜仲皮内生真菌种群以间座壳属占优势，遵义产地杜仲皮内生真菌以拟茎点菌属为优势属，见表1。 3.2内生真菌的多样性及相似性分析对不同产地分离出的内生真菌种群进行分析，计算不同产地杜仲内生真菌的多样性指数及相似性系数
12、，见表2。 Simpson优势度指数显示，略阳和慈利产地的杜仲皮内生真菌种群优势度指数较高，遵义产地的内生真菌种群优势度最低；Shannon-wiener多样性指数显示，以慈利和略阳产地的杜仲皮内生真菌种群多样性较高，遵义产地的多样性较低；Pielou均匀度指数显示，以略阳产地的最高，说明3个产地杜仲皮内生真菌的优势种群数量存在差异，遵义产地的杜仲皮内生真菌优势菌群集中，优势属突出，奇异度较高；慈利和略阳产地的杜仲皮内生真菌种群丰富度较高；略阳产地的杜仲皮内生真菌分布较均匀，奇异度较低。 表1不同产地杜仲树皮内生真菌分离情况及其分离频率 Table 1Distribution of endop
13、hylic fungi in Eucommia barks from different regions and their isolation frequencies% 表2不同产地杜仲皮内生真菌多样性指数 Table 2Diversity index of endophylic fungi in Eucommia barks from different regions 根据Sorenson公式，从属的层面上计算，不同产地杜仲皮内生真菌的种群结构相似性系数分别为0.600（慈利和略阳产地），0.600（遵义与略阳产地）和0.833（慈利与遵义产地），说明不同产地杜仲皮内生真菌的种群结构差异
14、较大，多样性不一。 3.3不同产地来源的同属菌株系统发育树的构建针对拟茎点菌属和间座壳属（其有性态亲缘属），选取不同产地杜仲皮中两属代表性菌株分别采用NJ法与MP法综合建树发现，2种方法建树拓扑结构基本一致，说明所建系统发育树可靠，见图1。 根据NJ系统发育树看出，L14和Z22菌株，L6，C4A2，Z6菌株间亲缘关系较近。3个产地的杜仲皮内生菌株总体分为了4个层次，各层次进化距离不同，分支复杂，说明杜仲皮内生拟茎点菌属和间座壳属菌群结构复杂多变，具有较丰富的遗传多样性。 3.4同属内生真菌菌株ITS序列遗传距离分析采用MEGA5.1根据Kimura 2-parameter分析得到序列间遗传距
15、离，见表3。 3个产地杜仲皮中拟茎点菌属和间座壳属16株代表内生菌株的遗传距离平均值为0.041。菌株L6和Z6，L1和C5A1，L14和Z22的遗传距离最小，为0.002，其ITS序列为同源序列，说明不同产地杜仲皮内存在部分共性内生菌株；而慈利产地杜仲皮内生真菌中的C7A菌株与其他菌株间的遗传距离较大，最大为0.095，说明其与其他同属菌株亲缘关系较远，存在较大的差异性。 略阳产地和遵义产地杜仲皮组织中两属内生菌菌株总的平均遗传距离为0.049，略阳产地和慈利产地杜仲皮中两属菌株间的平均遗传距离为0.046，慈利产地和遵义产地杜仲皮中两属菌株间总的平均遗传距离为0.051。说明来源于慈利和略
16、阳杜仲组织的菌株遗传距离较小，亲缘关系较近，而来源于慈利与遵义组织内生菌株间的亲缘关系较远。 其中C，L，Z分别代表慈利样品、略阳样品、遵义样品中分离出的菌株。 图1基于ITS测序结果的拟茎点菌属和间座壳属邻接法系统发育树 Fig.1Neighbour-joining distance-based phylogenetic analysis of the ITS data 表3不同产地杜仲皮中两亲缘属（拟茎点菌属和间座壳属）内生真菌菌株间的遗传距离 Table 3The genetic distances between two genera （Phomopsis sp. and Diapor
17、the sp.） in Eucommia barks from different regions 4讨论 不同产地来源的杜仲皮组织中均有链格孢属Alternaria、拟茎点菌属Phomopsis、间座壳属Diaporthe 3个属的分布，并且为共有的优势种群。也有报道证实，从杜仲的根、茎、叶组织中分离得到丰富多样的内生真菌，其中以链格孢属为优势种群16 。可见这类菌群在杜仲组织中分布较为普遍。链格孢属和拟茎点菌属为世界上普遍存在的真菌类群，广泛存在于土壤及植物组织中，在丹参17、铁皮石斛14、南方红豆杉18等多种植物中被发现。有报道指出，从杜仲组织中分离出的未知种的拟茎点菌属菌株能产生杜仲降
18、压有效成分之一松脂醇二葡萄糖苷5 ；从几株南方红豆杉组织中分离出的链格孢属内生真菌发酵液提取物中检测出抗癌活性物质紫杉醇19等，均说明了内生真菌与宿主植物次生代谢的相关性，且链格孢属和拟茎点菌属真菌都具有一定的抗菌活性及抗氧化等作用20-21。 不同产地杜仲皮中内生真菌的组成和数量不同，优势种群存在差异。慈利产地的杜仲皮内生真菌中以链格孢属为优势属，遵义产地的杜仲皮内生真菌中以拟茎点菌属为优势种群，略阳产地杜仲皮内生真菌中以间座壳属为优势种群。从组成上看，慈利与遵义产地杜仲皮中分离得到6个属的内生真菌，略阳产地的杜仲皮中分离得到4个属的内生真菌。这有可能因为3个产地同期气温及降水的差异，使得部
19、分环境适应性较差的内生真菌活力下降，休眠甚至死亡，影响分离有关。因内生菌主要来源于土壤，由土壤微生物入侵后和宿主协同进化而来22，所以推测内生真菌组成和数量的差异可能与产地的土壤微生物，特别是根际微生物的种群结构及其数量有关。 根据本文对不同产地杜仲皮内生真菌的研究，结合其他文献资料23-24，初步分析产地对植物内生真菌多样性及其种群、数量差异的影响，可能是由地区气候特征、土壤及周围植被的不同，造成大气中的微生物组成、根际土壤微生物种类分布25-26等的差异影响。而不同产地植物本身次生代谢产物积累不同，植物生理环境中pH、营养物质组成等的变化也有可能对杜仲内生真菌有影响，具体原因还需在今后的工
20、作中进一步研究。 参考文献 1周政贤，郭光典.我国杜仲类型、分布及引种J.林业科学，1980，16（增刊）：84. 2张鞍灵，马亚团，赵德义，等.杜仲叶次生代谢物季节和地域差异性研究J.林产化学与工业，2009，29（5）：104. 3王兴宁.杜仲叶黄酮类成分含量与土壤环境因子相关性研究D.贵阳：贵州师范大学，2008. 4李雅，宋晓斌，马养民，等.杜仲内生真菌对植物病原真菌的抑菌活性研究J.西北农林科技大学学报：自然科学版，2007，35（2）：69. 5刘超，师俊玲，周小娟，等.产PDG杜仲内生菌的分离筛选和分类鉴定及生长条件研究J.西北农林科技大学学报：自然科学版，2011，39（1）：
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28、 Comparative study on distribution of endophytic fungi in Eucommia barks from different habitatsLIANG Xue-juan1，3， ZHANG Shui-han1*， ZHANG Ping2， PENG Fei3， KE Jian4， MI Ya-nan1 （1. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410013， China； 2.College of Life Science， Hunan Normal University， Changsh
29、a 410081， China； 3.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 4. Lueyang Service Center of Technology Extension for Traditional Chinese Medicine， Lueyang 724300， China）AbstractA total of 152 strains of endophytic fungi were isolated from the barks of Eucommia ulmoides in three reg
30、ions （Lueyang country， Zunyi country， Cili country）. Based on morphological characteristics and analysis of ITS sequences， these strains were identified into 8 genera. Thereinto Phomopsis， Diaporthe and Alternaria were common genera to Eucommia barks from different sites. But the dominant genus was
31、different： Alternaria was the dominant genus in the barks from Cili country， and Phomopsis was the dominant genus from Zunyi country， then Diaporthe was the one from Lueyang country. According to the similarity coefficient， the composition of the endophytic fungi was distinctly different between the
32、 barks from three sites. The diversity and species richness in Lueyang country and Cili country were found higher than those in Zunyi country. The evenness of endophytic fungi was 0.936 5 in Lueyang county，which was higher than 0.737 1 or 0.641 0 in Cili county or Zunyi county， respectively. After p
33、hylogenic analysis and calculating the genetic distances of typical strains belong to Phomopsis and its perfect stageDiaporthe， there was very high genetic diversity in the two genera from our study. In conclusion， the community structure and diversity of endophytic fungi were significant different in Eucommia barks from the three habitats. Key wordsbarks of Eucommia ulmoides； habitats； endophytic fungi； ITS； diversity doi：10.4268/cjcmm20140209第 15 页 共 15 页
