1、中国ALK融合基因阳性非小细胞肺癌诊断共识,2013 V1.0（草稿）,中国ALK融合基因阳性非小细胞肺癌诊断共识,目的：提高我国ALK融合基因型肺癌的个体化精准治疗能力 （precision therapy）非小细胞肺癌的个体化靶向治疗：伴随分子诊断是前提虽然ALK融合基因阳性患者仅占NSCLC的5%，但是总体患者负荷较大，治疗需求迫切ALK融合基因阳性NSCLC具有独特临床&病理、治疗和预后特征，已成为NSCLC中的一个分子亚型第一个ALK抑制剂克唑替尼已获得SFDA的批准（2013.01）,ALK prevalence in China,中国ALK融合基因阳性非小细胞肺癌诊断共识,总体原
2、则综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子分析方法的特点、实验室自身条件，需要多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保证ALK融合型肺癌的检出率和准确率从临床诊断角度出发，综合最新的研究数据，并结合SFDA批准的伴随诊断方法，定期更新，保证检测结果的可信性和临床实际可操作性,ALK+ target population,ALK+ can be enriched in clinical factors: age, histology, smoking statusALK+ can be enriched in molecular subtypes: EGFRwt, KRASwt, and A
3、C30% in Caucasian pts(AC, EGFR wt and KRAS wt)42% in Chinese mailand pts (AC, EGFR wt and KRAS wt)34% in Taiwanese pts (AC EGFRwt )ALK+ concomitant with EGFR mutations: GLCI data: 1.3% (13/977) overally; in EGFR mut pts, 3.9% (13/336) co-alteration rate; in ALK+ pts, 18.6% (13/70) co-alteration rate
4、EURTAC data (2012 ESMO by Rosell): in EGFRmut pts, 15.8% (15/95) co-alteration rate,GLCI internal data;Rosell, ESMO 2012;Horn, JCO 2011,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,EGFR突变检测,腺癌（粘液性或实性，signet cell？）,阴性或unknown,下一步,组织标本类型 手术、活检标本： FFPE标本：推荐FISH、RT-PCR、IHC 新鲜标本：推荐RT-PCR 细胞学标本： 细胞沉渣（pellet）：RT-PCR 细胞
5、蜡块（cell block）：推荐FISH、RT-PCR、IHC,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,EGFR突变检测,腺癌（粘液性或实性，signet cell？）,阴性或unknown,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,石蜡标本,Ventana IHC,手动IHC检测* ？,阳性,阴性,FISH,RT-PCR多重PCR或RACE,*: 对于部分无条件行Ventana IHC检测的中心，手动ALK IHC可作为替代的筛选方法: 如果是细胞学样本，推荐使用RT-PCR检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选,3+/2+/
6、1+,ALK融合基因阳性非小细胞肺癌,ALK分离探针FISH原理,3-ALK探针杂交端粒的断点大约是300 KB，并用橘色荧光标示。 5-ALK探针杂交着丝粒的断点大约是442 kb，并用绿色荧光标示。,Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit. 06N38-020, 30-608495/R2,FISH诊断,橘红色与绿色探针相互临近或粘合：ALK 阴性,橘红色与绿色探针相互分离或单个橘红色探针：ALK阳性,FISH检测的局限性,结果判读需标准化，必需经过培训的病理科医师进行判读晚期患者小活检标本(2mm)，很难保证每个视野存在50个癌细胞价格昂贵，2600元左右
7、/例，无法适用于筛选,FISH检测的优势,目前，临床研究的结果均是以FISH为检测手段,False positivity vs false negativity .,Split-signal FISH:,Fusion-signal FISH:,Translocation-positive,Translocation-negative,False-positive,False-negative,Microscope:,Sample/nucleus:,Slide:,ALK FISH interpretaion criteria: 15% split signals, at least 50 tum
8、or cells were analyzed, if the result is equivocal, additional 50 tumor cells should be counted.Positive cells: separated green and orange signals or single red signals identified cells with rearranged ALK;Negative cells: overlapping of orange and green signals (yellowish) indicated cells in which A
9、LK was not rearranged.,Martelli MP, Sozzi G, Hernandez L, et al. EML4-ALK rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. Am J Pathol. 2009 Feb;174(2):661-70,Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer wh
10、o harborEML4-ALK. J Clin Oncol 2009;27:424753.,The assay should be only on 10% neutral buffered FFPE human lung tumor tissue. Other types of specimens or fixatives should not be used.,Cancer, 2012,Crizotinib 临床疗效与ALK+ 无关:ALK+% 分离率并非疗效就更好 ALK+%分离率低并非疗效不好,A Dramatic Response to Crizotinib in a NonSmal
11、l-Cell Lung Cancer Patient with IHC-Positive and FISH-Negative ALK,Sun, Jong-Mu, et al.Journal of Thoracic Oncology. 7(12):e36-e38,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,EGFR突变检测,腺癌（粘液性或实性，signet cell？）,阴性或unknown,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,石蜡标本,Ventana IHC,手动IHC检测* ？,阳性,阴性,FISH,RT-PCR多重PCR或RACE,*: 对于部分无条件行Ventana I
12、HC检测的中心，手动ALK IHC可作为替代的筛选方法: 如果是细胞学样本，推荐使用RT-PCR检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选,3+/2+/1+,ALK融合基因阳性非小细胞肺癌,在 ALK融合阴性的患者，免疫组化显示无ALK表达。,RT-PCR,FISH：进行Vysis LSI ALK双色打散FISH探针检测到ALK融合（分裂的红色和绿色信号）。,http:/dx.doi.org/10.1155/2013/757490,对 AmoyDx EML4-ALK融合基因检测，实时RT-PCR显示delta Rn对PCR循环数的变化。,在 ALK融
13、合阳性的患者，免疫组化显示ALK表达。,RT-PCR临床检测数据：腺癌发生率7.7%,Probaility of disease-free survival,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0.0,6.0,18.0,12.0,24.0,Time(months),Logrank,P=0.006,ALK positive ALK negative,J. X. Zhou，et al. Annals of Oncology 00: 17, 2012 doi:10.1093/annonc/mds626,多重RT-PCR测序,EML4-ALK变异体的多种引物，GAPDH作为对照,GLCI内部数据：
14、所有12个ALK融合阳性样品均通过多路RT-PCR测序技术得以证实。,RACE-PCR,Takeuchi et al. Multiplex Reverse Transcription-PCR Screening for EML4-ALK Fusion Transcripts. Clin Cancer Res 2008;14(20): 6618,Zhang et al. Molecular cancer 2010,融合序列捕获的确定性,XC Zhang，YL Wu et al. 2012 ESMO，,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,EGFR突变检测,腺癌（粘液性或
15、实性，signet cell？）,阴性或unknown,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,石蜡标本,Ventana IHC,手动IHC检测* ？,阳性,阴性,FISH,RT-PCR多重PCR或RACE,*: 对于部分无条件行Ventana IHC检测的中心，手动ALK IHC可作为替代的筛选方法: 如果是细胞学样本，推荐使用RT-PCR检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄5%的肿瘤细胞呈现颗粒状细胞质强着色；IHC 2+：5%的肿瘤细胞呈现中度细胞质着色；IHC 1+：5%的肿瘤细胞呈现微弱或模糊的细胞质着色或5%的肿瘤细胞有任何程度的着色；IHC 0：肿瘤细胞
16、无着色。”,E Thunissen, et al. Virchows Arch(2012)461:245-257,日本肺癌协会ALK诊断共识,Yoshiko Murakami, et al. Frontiers in Oncology .2012;doi: 10.3389/fonc.2012.00024,欧洲11家中心病理科ALK诊断共识,Thunnissen E, et al. Virchows Arch . 2012;461:245257,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,EGFR突变检测,腺癌（粘液性或实性，signet cell？）,阴性或unknown,
17、据组织类型选择合适技术,新鲜标本,石蜡标本,Ventana IHC,手动IHC检测* ？,阳性,阴性,FISH,RT-PCR多重PCR或RACE,*: 对于部分无条件行Ventana IHC检测的中心，手动ALK IHC可作为替代的筛选方法: 如果是细胞学样本，推荐使用RT-PCR检测 虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选,3+/2+/1+,ALK融合基因阳性非小细胞肺癌,Ventana IHC 试剂设计,ALK融合蛋白:无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表达较低Ventana IHC的原理:使用具有高度敏感性和特异性的一
18、抗D5F3全自动仪操作，充分保证特异性独有Optiview扩增技术，充分保证敏感性,D5F3 rabbitt monoclonal antibody,Optiview DAB IHC Detection,Optiview Amplification Kit,FISH阳性标本使用IHC检测,全自动Ventana IHC：信号扩增,常规IHC：无信号扩增,D5F3 rabbit mAb,Control rabbit mAb,ALK-positive NSCLC by Vysis FISH and Ventana ALK IHC,ALK (+) 病例,ALK (+) 病例,D5F3 rabbit m
19、Ab,Control rabbit mAb,ALK-positive NSCLC by Vysis FISH and Ventana ALK IHC,D5F3 rabbit mAb,Control rabbit mAb,Large majority of positive cases exhibit strong staining.,全自动Ventana IHC,判读标准简单，仅存在阴性 or 阳性的判读IHC 阳性 = FISH 阳性,EC Minca, et al. J Mol Diag, 2013,Ventana IHC：判读标准简单客观,VENTANA. 1011623EN Rev C
20、.2012; FT0700-410f,IHC 阳性=FISH阳性,IHC 阴性=FISH阴性,全自动Ventana IHC,全自动检测，避免操作流程中的误差，可重复性好,全自动Ventana IHC,价格便宜，可同时用于ALK的筛选和诊断,EMEA（欧盟）批准Ventana IHC用于诊断ALK阳性NSCLC，从而帮助确定可使用克唑替尼的患者,中国患者检测价格预估250元/例,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,EGFR突变检测阴性或unkown,是否必须在富集人群中检测ALK？,下一步,是否需要富集人群检测ALK：EGFR突变？,EGFR与ALK双突变的存在：5%
21、-8%EURTAC研究中：双突变概率15.8%（RT-PCR法）有文献报道，双突变患者克唑替尼治疗有效,是否需要富集人群：临床因素,如果按照临床因素富集，将漏诊33%（2/6）的ALK阳性患者,Yoshiko Murakami, et al. Frontiers in Oncology .2012;doi: 10.3389/fonc.2012.00024,是否需要富集人群：病理因素,如按病理因素富集：可能会遗漏30%(5/17)的ALK阳性患者,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,EGFR突变检测,阴性或unknown,据组织类型选择合适技术,新鲜标本,石蜡标本,V
22、entana IHC,手动IHC检测*,阳性,阴性,FISH,RT-PCR多重PCR或RACE,*: 对于部分无条件行Ventana IHC检测的中心，手动ALK IHC可作为替代的筛选方法: 如果是细胞学样本，推荐使用RT-PCR检测 虚线：建议优先在富集人群（粘液性腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选。,3+/2+/1+,ALK融合基因阳性非小细胞肺癌,Q1：是否必须在富集人群中检测ALK？,Q2：手动IHC的判读标准？,Q3：是否需推荐细胞学的诊断方法？,谢谢！,宗旨：“提高临床肿瘤标志物的应用实践能力”依照CSCO“团结、协作、务实”的服务精神和“服务、协调、引导”的工
23、作理念，开拓进取、不断创新,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,Ventana IHC,ALK IHC检测*,IHC阳性（3+/2+/1),IHC阴性,阳性,阴性,ALK融合基因阳性非小细胞肺癌,FISH,EGFR突变检测，如阴性,RT-PCR多重PCR或RACE,*: 对于部分无条件行Ventana IHC检测的中心，手动ALK IHC可作为替代的筛选方法: 如果是细胞学样本，推荐使用RT-PCR检测虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选,中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断流程图,NSCLC 活检组织标本,Ventana IHC,ALK IHC检测*,IHC阳性（3+/2+/1),IHC阴性,阳性,阴性,ALK融合基因阳性非小细胞肺癌,FISH,EGFR突变检测，如阴性,Q1：是否必须在富集人群中检测ALK？,Q2：手动IHC的判读标准？,RT-PCR多重PCR或RACE,*: 对于部分无条件行Ventana IHC检测的中心，手动ALK IHC可作为替代的筛选方法: 如果是细胞学样本，推荐使用RT-PCR检测虚线：建议在富集人群（粘液性腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄60岁）中进行筛选,Q3：是否需推荐细胞学的诊断方法？,
