1、,微生物检验流程与质量控制,主要内容,常见标本的检验流程血培养（无菌体液培养）痰培养（以及其他呼吸系统标本）尿培养粪便培养质量控制人员能力试剂与仪器（包括仪器校准、各项鉴定试验、药敏试验室内质控）环节控制（全程质控）首代分离培养基质量控制,常见标本的检验流程,血培养标准化操作流程,样本接收,推片法制片,染色镜检,血培养仪增菌,阳性培养液涂片,一级报告,首代培养,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,痰培养标准化操作流程,样本接收,痰液洗涤,压片法制片,染色镜检,肉眼筛选分类,镜下筛选,痰液消化,痰液接种,首代培养,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,尿培养标准化操作流程,样本接收,沉渣涂片,离心,镜
2、下筛选,染色镜检,首代培养（菌落计数）,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,粪便培养标准化操作流程,样本接收,镜下筛选（粪便常规）,压片法制片,染色镜检,选择性增菌培养,首代培养,目标菌落选取,鉴定药敏,综合报告,其他标本标准化操作流程,实用临床微生物检验与图谱卫生部规范化操作流程图,9,质量控制,概念,狭义质量控制：对试剂和仪器的控制广义质量控制：对所有影响试验结果可靠性的因素进行的全面质量控制试验人员技术能力的控制操作的标准化与试验结果判读的标准化试剂的保存与正确使用仪器的正确使用、定期维护与校准鉴定试剂阴阳性结果的典型性与试剂的稳定性考察药敏试验（纸片、MIC板卡、E-test试条、MH培
3、养基等）的室内质控严格但合理的首代分离培养基质控措施流程中不同环节试验之间的相互印证,质量控制中的重点,人员能力的培训、考核与权限的授予流程中不同环节试验之间的相互印证首代分离培养基质控措施药敏试验室内质量控制,人员能力的培训、考核与权限的授予,在所有影响因素中，人的因素居于首位临床微生物检验是一个智力因素占首要地位的行业，是真正意义上的诊断学。在欧美从属于临床病理的范畴基础知识的扎实程度、临场实践能力的高低、自主学习能力的强弱直接影响工作质量的好坏个人能力在报告质量中有直接而明显的体现,人员能力的培训、考核与权限的授予,在微生物室对后进人员的培训考核是一项长期任务，对于人才梯队的形成和特殊能
4、力的传承有着重要意义根据每个人员能力的层次分别授予对应等级的权限对于控制微生物室整体质量，防范错误的发生，提高报告质量有确定的意义,流程中不同环节试验之间的相互印证,建立全程质控的观点对于提高微生物检验质量意义重大通过不同环节试验结果之间的推衍和反证可及时发现一些错误的存在，并及时进行纠正可防止错误报告的发出不同环节之间的推衍与反证可让我们发现平时质控中难以发现的失控现象，便于我们制订相应的规则堵住漏洞，对于工作的持续改进有着重要的意义,首代分离培养基质控措施,目前国内有超过10家商品成品培养基制造商，由于生产工艺简单，技术壁垒较低，有无研发实力的公司都来趟这趟浑水，导致成品培养基市场非常混乱
5、，质量良莠不齐首代分离培养基是制约微生物检验阳性率的门户，分离到细菌是一切成功检验的前提条件。其质量的好坏直接影响微生物检验的整体质量。在“检验中”阶段，所有影响因素中，该因素所占的比重最大,药敏试验质控,过程控制结果控制,药敏试验过程控制,扩散法,试验方法与条件,CLSI推荐培养基：普通营养要求细菌使用水解酪蛋白琼脂（MHA）平板肺链使用含5%绵羊血的含血MHA嗜血杆菌使用HTM培养基淋球菌使用含1%生长因子（不含L-半胱氨酸）补充剂的GC培养基平皿大小：最小90mm，通常使用150mm平板琼脂厚度41mm菌液浓度0.5 McF（约1.5108CFU/ml）,涂布方法：无菌棉签浸透菌液后稍微
6、挤干，棉签与平板呈30左右的倾角密集左右来回涂布，完成一遍后旋转120后再涂，如此三次，最后绕边缘一次纸片之间最佳间距30mm，不得低于25mm培养温度；35；重叠时不超过3个碟子气体环境：普通细菌大气环境；嗜血杆菌、淋球菌、肺链置CO2环境培养时间：18小时,测量方法,透射光葡萄球菌利奈唑胺苯唑西林万古霉素肠球菌万古霉素,反射光测量其他细菌与药物时,变形杆菌忽略环内的迁徙生长,测量肉眼可见的明显抑菌区忽略环边缘的微弱生长,环内生长现象,大肠药敏，被肠球菌污染,铜绿假单胞菌耐药亚群,特殊处理方法,当受测抑菌环与旁边的融合时，选择完整部分测量当受测抑菌环部分变形时，选择正常部分测量,扩散法药敏影
7、响因素,培养基pH值7.2-7.4营养程度（肠球菌能生长）厚度抗生素拮抗剂含量（用29212监控）钙镁离子含量、锌离子含量（用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控）菌悬液浓度高抑菌环缩小浓度低则扩大,细菌纯度气体环境普通细菌放CO2时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药苛养菌放普通环境生长不良，导致假敏感培养时间粘液性铜绿需48小时测量方法,稀释法,试验方法与条件,CLSI推荐培养基：普通营养要求细菌使用补充阳离子MH肉汤肺链使用含2%冻融马血的MH肉汤嗜血杆菌使用HTM肉汤厌氧菌和微需氧菌使用布氏肉汤淋病奈瑟菌推荐强化GC作琼脂稀释法菌液浓度（5104CFU/ml）：初始菌
8、液0.5 McF（约1.5108CFU/ml）盐水稀释200倍，加入0.1ml菌液到含有0.1ml 双倍浓缩的MH肉汤的微孔板中（或预先用标准浓度的MH肉汤稀释后再加到微孔中）,接种后应充分混匀，但不能有气泡产生静置培养培养温度；35气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2培养时间：18小时结果读取：见后面的幻灯：,常量稀释法,药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中. 过夜培养. MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值.,微量肉汤稀释法,微量肉汤稀释法结果读取技巧,磺
9、胺类药物容易出现弱生长，只要满足70%以上抑菌率即可视为未生长真菌药敏三唑类药物容易出现拖尾现象（即低浓度孔易出现弱生长），判读时以对照孔为参照，80%的抑菌率即可视为未生长大于三孔不同梯度浓度的抗生素测试中，出现的高浓度生长，而低浓度不生长现象叫跳孔。造成跳孔的主要原因，菌悬液乳化不充分，细菌分散不足，以及药敏卡某些孔被污染跳孔的解决方法：根据其他药理学特征类似的抗生素的敏感性以及分析其他同类不同种抗生素的敏感性进行推断性修正修正低浓度耐药修正高浓度敏感,肉汤稀释法注意事项,生长缓慢微生物（形成肉眼可见生长1周）不适合用MIC法在肉汤中发育不良的微生物不适合用MIC粘液性铜绿假单胞菌只能用扩
10、散法，48小时观察结果淋病奈瑟菌CLSI无肉汤稀释法药敏指南注意微弱生长导致的假敏感（结果需要修正）例如铜绿对磺胺、四环素、头孢噻肟/曲松鲍曼不动杆菌对氨曲南肺克、阴沟、变形杆菌对呋喃妥因,稀释法药敏影响因素,培养基pH值 7.2-7.4营养程度抗生素拮抗剂含量钙镁离子含量（钙10-25；镁10-12.5g/ml）菌悬液（5104CFU/ml）接种效应浓度高MIC抬高浓度低MIC压低,细菌纯度气体环境所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放CO2，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药培养时间真菌需48小时奴卡菌需5天,E-test法,MIC 值标注于试条的光面,Etest 试条,毛
11、面贴于MHA上,Etest 操作程序,按照扩散法标准操作涂布接种,贴上试条并培养15-18小时,读取抑菌浓度并按标准解释,肺炎链球菌青霉素 MIC = 3 g/ml,结果读取,,药敏试验结果控制,药敏试验结果解释标准,CLSI标准；全球性每年更新非强制性学术机构FDA标准（全球标准）建立在CLSI基础上68年更新一次官方机构，标准带有强制性法国CASFM标准； 梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准英国BSAC标准； 欧洲应用比较广泛的标准欧洲EUCAST标准 .,CLSI药敏解释标准,CLSI (Clinical Laboratory standard institution)药敏指南,CL
12、SI,CLSI 药敏文件,M100-S22 常见菌 (2012)*M11-A7 厌氧菌 (2007)M39-A3 积累抗菌谱(2009)M24-A 分枝杆菌, 奴卡菌, 以及其他需氧放线菌M27-A2 酵母样真菌MIC法(2002)M44-A 真菌纸片扩散法(2004)M45-A 低频分离菌与苛养菌(2006),*M100 updated yearly,45,CLSI M100-S22 解释标准覆盖的细菌类别,肠杆菌科铜绿假单胞菌不动杆菌属洋葱伯克霍尔德菌嗜麦芽窄食单胞菌其他非肠道杆菌葡萄球菌属肠球菌属,流感嗜血杆菌与副流感杆菌淋病奈瑟菌肺炎链球菌-溶血链球菌草绿色链球菌脑膜炎奈瑟菌厌氧菌,不
13、同细菌适用的药敏方法,部分细菌同时具有扩散法标准和MIC标准，但具有扩散法标准的药物相对较少部分细菌（某些药物）只有MIC标准其他非肠道细菌所有药物葡萄球菌万古霉素、托达霉素肠球菌托达霉素肺链除苯唑西林以外的其他内酰胺类溶血链球菌除青霉素、氨苄青霉素、头孢吡肟、噻肟、曲松外的其他内酰胺类草绿色链球菌除头孢吡肟、噻肟、曲松外的其他内酰胺类厌氧菌所有药物淋菌只有扩散法和琼脂稀释法，无肉汤稀释法标准,少见菌和苛养菌的特殊药敏,参考方法：M45-A乏养菌与颗粒链菌稀释法嗜水气单胞菌复合群稀释法与扩散法弧菌属细菌（霍乱除外）稀释法与扩散法芽孢杆菌属（炭疽除外）稀释法空肠/大肠弯曲菌稀释法与扩散法棒状杆菌
14、稀释法（可用的药物标准比BSAC标准提供的多）,Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria；Approved guideline,猪红斑丹毒似菌稀释法HACEK组苛养性G-杆菌稀释法卡他莫拉菌稀释法产单核细胞李斯特菌稀释法巴斯德菌稀释法其他，如乳杆菌、片球菌、无色藻菌稀释法,分枝杆菌, 奴卡菌, 以及其他需氧放线菌药敏,参考方法：M24-A结核分枝杆菌复合群比例法缓慢生长非结核分枝杆菌稀释法快速生长分枝杆菌稀释
15、法奴卡菌等需氧放线菌稀释法,Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard,真菌药敏,M27-A2用于酵母样真菌的稀释法药敏只有氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶有解释标准，其他药物的测试结果报告MIC M44-A用于酵母样真菌的扩散法药敏只有氟康唑有解释标准M38-P用于丝状真菌的稀释法药敏只有操作方法，报告MIC值，但无解释标准,药敏试验质量控制要点,意义：保障药敏结果的可靠性准确性和精密度控制环节要点（重要的五大环节）：*质控1：人员操作能力
16、质控2：菌液浓度（比浊）质控3：培养基质量质控4：药敏试剂（纸片或MIC试卡/板）、读取药敏结果的仪器设备*质控5：异常结果的发现与修正参照指南：CLSI文件,*质控1：人员,标准操作指南：扩散法参照CLSI-M2文件；MIC法参照M7文件考核内容：基本操作步骤的熟练程度结果的正确读取,人员：操作步骤的熟练程度,按照标准程序操作，能在15分钟内完成单个分离菌的药敏试验操作操作过程：菌落的挑取手法菌液的配制操作与菌液混匀操作扩散法中菌液涂布操作MIC法中菌液的稀释操作仪器法中仪器的标准操作手法菌悬液纯度和浊度的验证性操作；,人员：结果的正确读取,抑菌环的正确测量忽略边缘的微弱生长环内生长的检测污
17、染菌的发现或耐药亚群的分离确认MIC值的正确读取包括跳孔现象的发现与纠正微弱生长孔的发现与结果修正（磺胺、四环、氯霉素、氨曲南）拖尾现象的正确忽略（磺胺、真菌）生长不良的确认与补救措施（重做、延长）,质控2：菌液浊度控制,目测法控制内容：主要是0.5McF浊度的感知能力参照物：0.5 McF硫酸钡比浊管，对应1.5108 CFU/ml 参考方法：菌液稀释后菌落计数法允许误差：1.5107 1.5109 CFU/ml 仪器法控制内容：同上校准品：0.54 McF硫酸钡比浊管参考方法：同上允许误差：同上,质控3：MH培养基质量控制,pH值 7.2-7.4营养程度：不加血的情况下就能支持ATCC 2
18、9212的生长 抗生素拮抗剂含量：使用ATCC 29212监测，扩散法有抑菌环出现，并且环内只允许微量小菌落出现；MIC法抑菌率80%钙镁离子含量：钙10-25、镁10-12.5g/ml锌离子含量：ATCC27853亚胺配能结果在允许范围内,质控4：药敏试剂质控,CLSI提供扩散法和稀释法的质控标准扩散法标准适合于纸片扩散法稀释法标准适合于微量肉汤稀释法、琼脂稀释法，以及E-test法内容标准菌株质控频率各种药物的控制范围,扩散法质控,菌株非苛养菌：肠杆菌科ATCC 25922 大肠；非发酵菌27853 铜绿；葡萄球菌25923 金葡；加酶抑制剂抗生素质控35218 产ESBL大肠苛养菌：嗜血
19、杆菌49247 流感，49766 流感用于补充，弥补49247某些不能检测的药物；淋菌用49226；肺链用49619,扩散法控制范围,点击放大,稀释法质控,菌株非苛养菌：肠杆菌科25922；葡萄球菌29213；肠球菌29212；非发酵菌27853；加酶抑制剂抗生素质控35218苛养菌：嗜血杆菌49247 ，49766 流感用于补充；淋菌用49226；肺链、其他链球菌，以及脑膜炎球菌药敏质控用49619 ；49226用于淋菌琼脂稀释法质控其他低频分离菌：根据相应的文件规定。一般都是选用上述质控菌株中的某些,稀释法控制范围,点击放大,自动化药敏仪器的质控,主要是光学部件读取数据时的准确性与稳定性由仪器内置自检部件按规定时间间隔自动进行，如果自检不能通过，仪器会报警通知人工处理，人工校正仍然过不了的应及时停用，并通知厂家工程师维修其次是仪器软件的定期升级。由于CLSI与FDA标准每年或每隔几年就会进行更新一次，仪器药敏判读软件也应作相应更新升级。有的更新需要同时更新鉴定板/卡上的抗生素浓度设置，需要注意的是更新后软件应与相应试剂配套，否则会导致错误结果的产生。,自动化药敏仪器的质控,需要注意的是在仪器光学部件维修后和软件更新后都必须进行连续5天的质控，只有5天内均合格仪器才能进入正常使用程序,质控频率,谢谢大家！,
