1、GE Healthcare凝胶基础知识培训,Resolution: depends on efficiency and selectivity,Efficiency: 评估峰的宽窄 高效意味着峰窄 高效意味着柱子装的好 高效可以弥补低选择性带来的不利,Selectivity: 评估峰的分开程度的 高选择性意味着两个峰从基线分开 假如选择性较高，低有效性可以接受 (前提是峰体积增大能接受).,如何选择凝胶？,五大类层析方法 - 1. 凝胶过滤 ( GC)2. 离子交换 ( IEX)3. 亲和层析 ( AC)4. 疏水层析 ( HIC)5. 反相层析 ( RPC),介质的普遍性质,介质 - 颗粒越
2、细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较 高 (SOURCE介质例外)，HP代表细颗粒，FF代表高流速，XL代表高载量。 Big Beads 物理稳定性 - 新一代介质较坚固，能承受高流速，同时保 持柱床体积和结构稳定，省却每次重新装柱，提高重复性化学稳定性 - 新一代介质能承受极端pH，高盐度，促溶剂 和有机溶剂，利于开发分离条件和在位清洗(CIP)，大大延 长介质寿命和提高重复性,BioProcess 凝胶,特别适合生产应用, 特点包括：高重复性：适用于任何规模的工艺放大高物理、化学稳定性：易于清洗、消毒及再生、介质 寿命特长高动力载量、流速快：缩短生产周期和次数，节省凝胶用量(尤其XL介质
3、，载量可比普通介质高达10倍！)每种凝胶均有完整的文献、档案和Regulatory Support File,融合蛋白质,非融合蛋白质,表达,简单纯化,一步 亲和层析,90 - 97 % 纯度,三步纯化策略,粗提中度纯化精细纯化,多步纯化,蛋白质纯化策略,适用於三步纯化策略的层析技术,层析技术,主要特色,粗提,中度纯化,精细纯化,IEX,高分辨率高载量快速,HIC,分辨率好载量一般快速,AC,高分辨率高载量快速,GF,高分辨率,RPC,高分辨率,目的纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析,分辩率,快速,回收率,载量,粗 提,粗提: 离
4、子交换填料,预装柱 20ml 颗粒大小 流速HiPrep 16/10 Q XL & SP XL 90 m 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE & CM 90 m 10 ml/min,Sepharose Big Beads,Sepharose Fast Flow,Sepharose XL,粗提: 疏水层析填料,HiPrep 16/10,HiTrapHIC 选择试剂盒,放大,Sepharose FF Phenyl (苯基) Butyl（丁基） Octyl(辛基）,中度纯化,目的 去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析,分辩率,快速,回收率,载量,中度纯化: 离子交
5、换填料,Sepharose HP 34 m,Q & SP,150 cm/hr,小包装和预装柱,交联琼脂醣,SOURCE 30 m,Sepharose High Performance,SOURCE 30,Q & S, 25 mg 上样载量,3 m: Mini Q & S,Mini Beads Q & S,200cm/hr)，非特异性吸附极低，适合工业规模生产。,Sephacryl,Sephacryl是葡聚糖交联,亚甲基二乙酰胺形成的。具有良好的机械性能，比传统的Sephadex化学稳定性高。可用.NaOH进行清洗。短期可使用有机溶剂，并可在121灭菌。也可使用变性剂。,Sephacryl 有6
6、种不同分离范围，提供广阔的选择性，甚至可分DNA质粒和病毒，经济、高效，反压低，易于自行装柱，是Superdex外作下游纯化的理想介质,SuperoseSuperose是由高度交联的琼脂糖形成的多孔球形结构。根椐颗粒大小分为两类：,操作pH为3-12，清洗时pH为1-14。如0.2M的NaOH和0.01M的HCl以及1M的乙酸。清洗时可用0.5M的NaOH和0.5M的HCl。同时，也可使用1%的SDS，8M的Urea和6M的Gu.Cl。可在pH7，121灭菌30Min。,Superose6, 12预装柱(HR10/30,13um) 有宽广的分离范围配合高分辨率，优化条件可在 Superose6
7、, 12 Prep Grade (20-40 um)直接放大,Superdex,Superdex是由高度交联的结合有葡聚糖的琼脂糖形成的多孔结构。具有低吸附，化学物理稳定性高，可0.1MHCl,.MNacl进行清洗。可使用高浓度的变性剂。,1. Superdex Peptide2. Superdex 753. Superdex 2004. Sephacryl S-100 HR5. Sephacryl S-200 HR6. Sephacryl S-300 HR7. Sephacryl S-400 HR,Kav,1.0-0.8-0.6-0.4-0.2-,1000 10,000 100,000 1,
8、000,000 10,000,000,1,2,3,4,5,6,7,凝胶过滤填料的分离范围,Superdex Peptide - 纯化小生物分子的新选择,市面上唯一分离范围是100-7000 的凝胶过滤介质选择性和分辨率高，颗粒大小 只有13um高化学稳定性，pH1-14都可工作，有机溶剂亦可，如 乙腈+三氟乙酸结合了Sephadex的高选择性和琼脂糖的高物理稳定性，在高 流速下不会变形,多肽样品的分析,离子交换介质,最受欢迎的层析纯化方法强阴Q、强阳S和SP、弱阴DEAE、弱阳CM分别在于 介质完全离子化的pH范围，较宽者为强，与结合强度无关；工作pH范围宽广，更易保持高载量，所以宜用 强者代
9、替弱者传统的纤维素介质如DE52，CM52由于流速慢，柱床 高度随缓冲液改变，又不能承受0.1M NaOH在位清洗 ，重生效果差，所以已被Sepharose Fast Flow 等为 基架的离子交换介质代替,Mono Q HR, Mono S HR 预装柱: 10um均一颗粒， 高分辨率，大量应用文献SOURCE15Q, 30Q, 15S, 30S：低压系统中分辨率 最高，颗粒大小均一，反 压低，可用蠕动泵操作， 流速 1000cm/hr以上仍然 保持高分辨率；RESOURCE 乃填满了 SOURCE 15um介质的预装 柱,Q and SP Sepharose High Performanc
10、e (34um): 琼脂糖凝胶中颗粒最小，分辨率最高，可作经济的精细纯化Q，SP，DEAE，CM Sepharose Fast Flow (45-165um): 高流速加上高载量，能快速纯 化大量粗产品和作中度 纯化Q and SP Sepharose Big Beads (100-300um): 高物理稳定性的大颗粒凝胶， 能在最短时间内浓缩、初步 纯化大量粗产品；亦适宜处理 高黏性样品,新一代层析介质 挑战载量极限！,XL介质拥有琼脂糖骨架配合葡 萄糖长链，大大增加高流速下 的动力载量大大减少柱床体积，降低放大 工艺时的成本,EXTREME LOAD,载量可比一般介质高达10倍！1ml Q
11、 Sepharose XL 可载 250mg BSA！,MORE COST-EFFECTIVE : protein purification,Capto Q,Capto MMC,耐高盐浓度的Capto MMC 弱阳离子交换凝胶,Macrocap SP PEG 蛋白的纯化,可分离单个PEG修饰蛋白孔径较大，适合分子量在20KD以上的特大蛋白载量较高100mgBSA/ml,亲和层析介质,Matrix(骨架）: an inert medium to which a ligand can be coupledLigand（配体）: a component which interacts specifi
12、cally with the targetCoupling（偶联）: covalent attachment of the ligand to the matrixBinding（结合）: association between the ligand and the target,亲和填料的种类,金属螯和填料： Cu2 ,Zn2+ ,Ni2+ , Co2+活化偶联的填料：NHS activated ，CNBr activated等。小配体亲和填料：Heparin,Arg,Benzamidine, GST,钙调因子抗体亲和填料：ProteinA ProteinG,IgM,IgY,Mabselec
13、t,IgG颜料亲和填料：Blue SepharoseHighperformance外源凝集素：ConA， Lentil核酸亲和介质：ADP,AMP,PloyA,PloyU,Plasmidselect,配体偶联在介质上，纯化能与配体结合的生物分子； 通常一步便能得到高纯的样品；配体的特异性越强， 所获产品纯度越高用抗体亲和介质提纯单抗非常方便，以重组蛋白A的载量最高；蛋白G则能结合更多不同源的IgG金属螯合介质(Chelating Sepharose Fast Flow) 可反复螯合不同金属，再用已结合依赖不同金属 的蛋白，一种介质可做多种纯化工作其他常用配体包括：肝素 - 纯化抗凝血酶III，
14、凝血因子脂酶等Cibacron Blue(颜料) - 纯化白蛋白，干扰素等外源凝集素如刀豆球蛋白A - 多糖，糖蛋白等Glutathione谷胱甘三肽 - 重组融合蛋白等等.可自行把所需配体偶联到活化偶联介质，最常用的是NHS activated 4 Fast Flow 和CNBr activated 4 FF； 要注意化学基最好不会参与配体和被纯化生物分子的 结合作用中,疏水层析介质,生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环 境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又 可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析 步骤的
15、桥梁，取代盐析沉淀技术比反相层析的配体密度低很多，无须有机溶剂洗脱， 保存生物活性配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合 ，可用疏水层析试盒选择介质,RESOURCE 疏水预装柱,有RESOURCE PHE(苯基)，RESOURCE ISO (异丙基) 和 RESOURC ETH(乙醚基)三种，疏水性由 高至低，适合精细分离用SOURCE15作基架，高流速(可达1800cm/hr)，时 仍有高分辨率，高稳定性(可用1M NaOH在位清洗， CIP)，重复性好低反压，除了FPLC 和 HPLC外，更可用蠕动泵操作,疏水介质选择,SOURCE RPC,聚苯乙烯/二乙烯基苯,pH 1 - 1
16、2 (14),肽类,5, 15 and 30 m,反相层析填料,反相层析SOURCE,30 m,15 m,5 m,凝胶的其他应用,测定分子量：用凝胶过滤介质；分离范围广阔的 superose HR预装柱很适合测定未知蛋的分子量。测定pI: 用少量的离子交换介质放在多个不同pH缓冲 液中，可简易地测出pI，并选择纯化用缓冲液的最佳 pH。去除内毒素(热源)：1.高盐下会凝集，无法上疏水柱，因此可用疏水层析试盒选择适合介质同时纯化目标蛋 白 ；2. 热源带负电，可用阴离子交换介质如Q Sepharose FF 吸附; 3. 偶联内毒素底物如LAL到 CNBr或NHS Sepharose FF, 自
17、制亲和介质；4. 内毒素经常是多聚体，用凝胶过滤可有效将之除去。用疏水柱去除发酵液中的色素。自制配体偶联介质捕捉未知蛋白。,StepMedia CIPLife lengthDesalting Sephadex G-25 C 4 cycles7,200 cycles or 2 yearsIEX 1 DEAE Sepharose 3 cycles600 cycles or Fast Flow 0.5 yearIEX 2CM Sepharose 3 cycles 1,200 cycles or Fast Flow 1 yearGFSephacryl S-200 HR 5 cycles800 cycl
18、es or 1 year,Media used in early step tend to have short life (crude samples)GF media tend to have longer life than IEX media (no absorption and desorption),填料的寿命,填料的清洗,常见污染物:Proteins (soluble & precipitated)Hydrophobic proteins or lipoproteinsLipidsNucleic acidsEndotoxinsVirus,Proteins,Method Colum
19、n Volumes Contact Timea. 0.5 % Non-ionicdetergent in1 M HAc 1-2 h b. 70 % Ethanol 5(2) 70 % Ethanol to be optimized(3) 30 % Acetonitrile to be optimized,Lipids,测定填料的动态载量,动态载量代表在定流速下介质的静态载量可用效率。采用迎头法测定：1、检测样品的平头信号2、将样品定流速上柱，直到流出液的信号达到平头信号的5。3、测定这段上样的蛋白量，就为填料的动态载量。,层析柱的种类,C柱系列简易层析柱，无夹套及flow adaptorXK柱
20、系列标准层析柱Tricorn(HR)柱系列高压层析柱（最大10Mpa）SR柱系列耐有机溶剂层析柱,大型层析柱,多种大小,材料可供选择,柱床体积高达千多升也可以订做经济型 INdEX 和 层叠柱制药用BPG 和CHROMAFLOW 柱极高标准的 BPSS 柱专为 SOURCE 填料设计的 FineLINE 柱,用空柱子须留意,使用调节器( flow adaptor ) - 保护柱床的同时更可提高 分辨率，节省凝胶柱子物料须生物兼容，并有尤良的化学抗性加上装柱器( packing reservoir )，可一步把凝胶装满柱 子，大大提高柱效，尤其是凝胶过滤柱柱子的过滤网孔径应该是凝胶颗粒的1/3, 一般10um孔 径就够用，如用SOURCE15介质装HR柱和XK柱，须换上5um的网需要压力装柱才有好的柱效的填料配合耐压柱,线性流速,对体积不同的柱子来说，体积流速不能直接用作比较， 一般都换算成线性流速，再作比较： 体积流速 ( ml/min ) x 60 线性流速 (cm/hr) = - 柱子横切面积 (cm2),装柱检测,检测装柱效果一般用0.5% (30um介质)或2% (90um 介质) 柱体积的1%丙酮测柱效和峰形柱效 HETP=L/NL:柱床高度N=理论塔板数N/m=5.54 X (Ve/W1/2)2 * (100/L) 每米理论塔板数Ve:保留体积W1/2:半峰高峰宽,
