1、StH2A-1 正向调控本氏烟顶端优势和正常开花 乔丽媛 拓宁 伍涵宇 殷倩 张晓萍 姚新灵 宁夏大学生命科学院/西部特色生物资源保护及利用教育部重点实验室 摘 要： 核小体中组蛋白 (histone, H2A) 与其变异体替换调控基因表达, 尽管研究已揭示了拟南芥 (Arabidopsis thaliana) H2A 参与生长发育调控, 但植物 H2A家族不同成员功能的研究极为有限;本研究克隆了马铃薯 (Solanum tuberosum) St H2A-1 基因 c DNA, 转化反义 St H2A-1 c DNA 于本氏烟 (Nicotiana benthamiana) 体内表达, H2
2、A 减少表达株系 h2a-1 叶片 Nb H2A 蛋白质含量低于对照 31%, 表现顶端优势缺失和开花推迟的表型;St H2A-1 预测氨基酸序列检索本氏烟基因组数据库, 识别了 5 个与 St H2A-1 相似性高于 97%的本氏烟 Nb H2A, 其 N 端均独具不同长度多聚丙氨酸基序;不同 Nb H2A 反转录聚合酶链式反应 (reverse transcription plymerase chain reaction, RT-PCR) 结果显示, h2a-1 株系叶片多聚丙氨酸 Nb H2A 编码基因 m RNA 积累明显低于野生型 (wild type, WT) , 但其他 Nb H
3、2A m RNA 在 h2a-1 中积累显著增加, 表明不同 Nb H2A 彼此可能功能互补;成花基因特异引物 RT-PCR 结果显示, h2a-1 株系中ELF4 (EARLY FLOWERING 4) 、CO (CONSTANS) 和 FT (FLOWERING LOCUS T) 基因 m RNA 积累下调, 意味着 Nb H2A-1 参与了成花基因的转录关联。研究结果表明, St H2A-1 基因与顶端优势形成和正常开花关联, 且正向调控植物生长发育。该研究结果有助于进一步理解 H2A 的生长发育调控功能。关键词： 组蛋白 (H2A) ; 抑制; 成花; 本氏烟; 作者简介：姚新灵, 收
4、稿日期：2017-05-13基金：国家自然科学基金项目 (No.31160236 和 No.31360275) StH2A-1 Positively Regulates the Apical Dominance and Floral on Time in Nicotiana benthamianaQIAO Li-Yuan TUO Ning WU Han-Yu YIN Qian ZHANG Xiao-Ping YAO Xin-Ling Education Ministry Laboratory on West Bioresource Protection and Utilization/Coll
5、ege of Life Science, Ningxia University; Abstract： The replacement of histone (H2A) with its variants in nucleosome regulates gene expression in plant. Although it is revealed that At H2A involves in regulation of growth and development in Arabidopsis thaliana, study on function of H2A family member
6、s in plant is rare. In this study, A St H2A-1 c DNA was isolated from potato (Solanum tuberosum) . A Nicotiana benthamiana transgenic line h2 a-1, expressing antisense St H2A-1 c DNA displayed 31% lower leaf H2A contents than wild type (WT) , leading to an apical dominancedeficient and late-flowerin
7、g phenotype. BLAST outcome in Nicotiana benthamiana genome database showed that 4 Nb H2As, sharing higher than 97% similarity with St H2A-1 uniquely contain a poly (Aln) motif with various length in the N-terminal of the amino acid sequences. Outcome of the reverse transcription polymerase chain rea
8、ction (RT-PCR) showed that accumulation of Nb H2A m RNA, encoding Nb H2A with N-terminal poly (Aln) was lower in the h2 a-1 line than it in WT. The other Nb H2As displayed a clearly higher m RNA accumulation in the h2 a-1 line than it in WT. This suggested that Nb H2As with and without N-terminal po
9、ly (Aln) may be complemented one another to function in gene expression regulation. RT-PCR also exhibited that m RNA accumulations of floral genes, including ELF4 (EARLY FLOWERING 4) , CO (CONSTANS) and FT (FLOWERING LOCUS T) in the h2 a-1 line were down-regulated, suggesting that Nb H2As with N-ter
10、minal poly (Aln) may involve in transcription of those genes. As a conclusion, St H2A-1 is associated with formation of apical dominance and regular flowering and positively regulates plant growth and development. The result may contribute to further understanding on function of H2A in plant growth
11、and development.Keyword： Histone (H2A) ; Inhibition; Floral; Nicotiana benthamiana; Received： 2017-05-13组蛋白 (histone, H2A) 是核小体八聚体 4 类组成组蛋白之一, 细胞分裂间期DNA 复制后, 组蛋白沉积于核小体 (Talbert et al., 2014) ;真核生物中, H2A 是高度保守组蛋白之一, 其中 H2A.Z 是进化中最为保守的 H2A 成员之一。尽管 H2A 在极为广泛的范围参与发育和代谢调控, 但植物 H2A 如何调控基因表达知之甚少 (Bonisch e
12、t al., 2012) 。植物 H2A 基因功能研究尚处于起始阶段。水稻 (Oryza sativa) 有 3 个基因编码组蛋白 H2A.Z (Hu et al., 2015;Xu et al., 2010) ;拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 基因组包含至少 3 个 H2A.Z 编码基因 (Yi et al., 2006) , 其中, 一个 H2A.Z 编码基因表达独立于细胞周期, 另外两个则表达于细胞分裂 S 期 (March-Diaz et al., 2009) , 植物基因组中H2A 由多个基因编码, 不同 H2A 变异体分化表达。组成核小体的 H2A 存在多个变
13、异体 (H2A variants) , 参与核小体组成的 H2A变异体随器官、发育阶段和植物种类而不同, H2A 变异体彼此替代交换, 调控包括开花在内的生长发育过程 (Jarillo et al., 2015) , 尽管替代交换的机制有待研究, 但 H2A 基因表达可能存在基因型或植物种类特异性。H2A 富集于转录起始点邻近的核小体, 下调 H2A 表达, 完全抑制 RNA 聚合酶与基因启动子的结合 (Teves et al., 2014;Weber et al., 2014) 。该发现表明, H2A 在转录水平参与生长发育调控。HTA9 (Gene ID:At1g52740) 和 HTA1
14、1 (Gene ID:At3g54560) 是拟南芥 H2A 编码基因, 两个基因插入失活的 hta9 hta11 双突变体, 表现不同的生长畸形性状, 包括顶端优势缺失、花朵较野生型小、花瓣数增加、雌蕊和角果更粗短、叶变少变小和开花提前;测定分析显示, 双突变体中 FT (FLOWERING LO-CUS T) 上调表达是早花的主要原因 (March-Diaz et al., 2008) , 揭示了 H2A 参与植物由营养生长转向生殖生长调控。转录组表达谱分析识别了 CO (CONSTANS) 和 FT (FLOWERING LOCUS T) 是成花起始表达基因 (Sreeharsha et
15、 al., 2016) , 环境因素调控 CO 和 FT 表达诱导成花, 光受体诱导 CO 表达, CO 参与 FT 表达计时并激活 FT 转录, 促进植物由营养生长转向生殖生长 (Young, 2016) 。拟南芥 hta9 hta11 双突变体 FT 上调表达导致早花的结果表明, H2A 参与了诸如光周期等的成花调控。拟南芥 ELF4 (EARLY FLOWERING4) 具有响应成花环境连续变化节律的生物钟功能, ELF4 与光生物钟途径 CCA1 (circadian clock-associated1) /LHY (long elongated hypocotyl) -TOC1 (t
16、iming of cab expression1) 关联, 且是光生物钟途径的组分之一, CCA1 和 TOC1 调控表达需要 ELF4 (Mc Watters et al., 2007) 。尽管 ELF4 是参与光响应的成花基因, 但 ELF4 与 CO-FT 成花途径如何关联并不明确。本实验室研究发现, H2A、CO 和 ELF4 的同源基因同时出现在马铃薯 (Solanum tuberosum) 短光照处理分化表达谱中, 尽管拟南芥 hta9 hta11 双突变体中因FT 上调表达导致早花 (March-Diaz et al., 2008) , 但 H2A 与 CO 和 ELF4 如何关
17、联尚未见报道, 且 H2A 单个基因功能是否可产生如 March-Diaz 等 (2008) 结果, 有待确定。本研究拟通过抑制 H2A-1 表达, 以期确定 H2AH2A-1 与 CO 和 ELF4 表达间的联系, 研究结果将加深对 H2AH2A-1 调控生长发育功能的理解。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 主要试剂植物基因组提取、RNA 提取试剂盒、DNA 胶纯化试剂盒 (minibest agarose gel DNA extraction kit) 、反转录聚合酶链式反应 (reverse transcription plymerase chain reaction, RT-P
18、CR) (SYBR Prime Script RT-PCR) 试剂盒、快速内切酶、T 4DNA 连接酶、DNA 聚合酶和 DNA 分子量标识购自大连宝生物工程有限公司;-D-葡萄糖苷酸酶 (-glucuronidase, GUS) 染色试剂盒购自中科瑞泰 (北京) 生物科技有限公司;用江苏凯基生物技术股份有限公司生产的植物蛋白提取试剂盒提取叶片蛋白;人 (Homo sapiens) 源组蛋白 H2A 酶联免疫分析 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 试剂盒购自上海酶联生物技术有限公司。引物合成和 DNA 测序由上海生物工程有限公司完成, p C
19、-35S 由本实验室前期构建 (Liu et al., 2012) ;大肠杆菌 (Escherichia coli) 菌株DH5、重组载体 DH-p C-35S 和根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 菌株 GV3101 均由本实验室保存。1.1.2 植物生长条件马铃薯 (Solanum tuberosum) 和本氏烟 (Nicotiana benthamiana) 植物材料试管苗生长条件为 16 h 光照/8 h 黑暗, 温度 2025, 光照强度 2 000 lx;试管苗生长达到 35 cm 后, 移栽到品氏泥炭土 (丹麦 pindstrup 集团) 培养基质
20、, 在 16 h 光照/8 h 黑暗, 温度 2025, 光照强度 2 000 lx, 相对湿度 60%80%, 土壤水含量 40%10%条件下培养 30 d 后, 采集幼叶, -80保存, 用于 DNA 和RNA 提取和表型测定。1.2 实验方法1.2.1 目的基因分离及载体构建依据短光照响应 H2A 基因序列, 设计特异引物 H2A-F/R, 引物序列:提取马铃薯叶片总 RNA, 反转录获得其 c D-NA, 以此为模本, 用 H2A-F/R 进行反转录聚合酶链式反应 (reverse transcription plymerase chain reaction, RT-CR) , 在 9
21、5预变性 4 min、94变性 30 s、62退火 45 s、72延伸 30 s 条件下完成 25 个 PCR 循环, 最后 72延伸 10 min;PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行观察, 回收产物并测序证实, 获得马铃薯 St H2A 基因 c DNA。液体培养 BL-p C-35S, 提取 p C-35S 并进行胶回收纯化, 按照快速内切酶使用说明, 用 Sac (6) 和 Bam H (6) 分别双酶切纯化 PCR 产物及 p C-35S 质粒 DNA, 纯化回收后, 按照说明用 T4DNA 连接酶建立连接反应, 将目的 DNA 片段反向连接于 p C-35S 载体的 35S 启动
22、子 3端, 连接产物热激转化大肠杆菌菌株 DH5感受态细胞, 细胞在含有抗生素的固体培养基上平板培养 12 h 后液体培养单个菌落, 用 35S 启动子特异引物:对抗性菌株进行 PCR 筛选, PCR 反义体系使用天根生物公司 (北京) 2Taq PCR Master Mix 推荐体系。反应条件为, 95预变性 4 min、94变性 30 s、56退火 45 s、72延伸 30 s, 完成 25 个 PCR 循环, 最后 72延伸 10 min, PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行观察, 依据观察结果筛选 PCR 阳性菌株, 提取 PCR 筛选阳性菌株质粒, 进行 Sac (6) 和 Ba
23、m H (6) 双酶切分析, 筛选获得目的基因反义 c D-NA 重组载体 p C-St H2A-1 及对应重组菌株为 DH5-St H2A-1。测序确认连接正确后, 培养重组菌株 DH5-St H2A-1, 提取并纯化 p C-St H2A-1 载体, 电击转化于根癌农杆菌 GV3101 菌株感受态细胞, 经过 50g/m L利福平 (rifampicin, Rif) , 50g/m L 庆大霉素 (gentamicin, Gen) , 50g/m L 卡那霉素 (kanamycin, Kan) 抗性筛选, 阳性抗性菌落进行同前的菌落 PCR 筛选, 获得重组菌 GV3101-St H2A-
24、1。1.2.2 表达反义 St H2A-1 株系筛选按照 Horsch 等 (1986) 的方法, 用 GV3101-St H2A-1 侵染本氏烟叶盘外植体, 获得本氏烟转化株系幼苗;以幼苗叶片基因组 DNA 为模板, 用 35S 启动子特异引物进行 PCR, 筛选获得 PCR 阳性株系;采集 PCR 阳性株系根, 对 PCR 阳性株系进行 GUS 染色筛选, 用 1.2.4 描述的方法, 完成 GUS 阳性株系表达 H2A 蛋白含量的 ELISA 测定。1.2.3 RT-PCT同 1.2.1 的方法提取本氏烟对照和 h2a-1 株系叶片总 RNA, 按照说明, 用如表1 所示的引物进行 RT
25、-PCR, 完成对不同 Nb H2As m RNA 积累的半定量测定;用表2 所示的引物, 完成成花基因 m RNA RT-PCR;其中, 内标基因用本氏烟延伸因子 (elongation factor 1-alpha, EF1) 基因 Niben101Scf34389g00002 (Nicot et al., 2005) , 内标基因特异引物如表 1 所示。表 1 本氏烟不同 Nb H2A 基因及其相应引物序列 Table 1 Primer sequences for genes of Nb H2A and Internal control 下载原表 表 2 本氏烟成花基因及其相应引物序列
26、Table 2 Primer sequences for flowering genes 下载原表 1.2.4 H2A 蛋白的 ELISA 测定提取蛋白原液样品分装后放置在-80保存, 每次使用前取出其中 1 份使用, 以免反复冻融样品;预实验后, 总蛋白含量分 3 次测定, 每次测定重复 3 次, 以g/L 单位计量蛋白含量。用人源 H2A 单克隆抗体制成的 ELISA 试剂盒测定转化和对照株系 H2A 含量。设置标准品孔、空白孔和待测样品孔, 待测样品每孔加入总蛋白 50g, 用样品稀释液补足体积至 50L, 用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度 (OD 值) , 通过标准曲线计算各
27、样品中的植物组蛋白 H2A 含量 (g/m L) ;预实验后, H2A 含量分 3 次测定, 每次测定重复 3 次。1.2.5 数据分析用 SPSS V19.0 中 ANOVA 完成测定数据的统计分析。2 结果与分析2.1 反义 St H2A-1 在本氏烟体内表达减少了其 Nb H2A 积累2.1.1 St H2A-1 c DNA 克隆用特异引物 H2A-F/R 进行 RT-PCR 获得了 St H2A-1 c DNA, 测定 St H2A-1 c DNA 序列及序列分析显示, 该 c DNA 序列长 478 bp, 其中包含 414 bp 的 ORF, 预测其编码 137 个氨基酸组成的多肽
28、, 与已报道的拟南芥 At H2A 家族成员HTA11 (At3g54560) 相似性为 91.2%, 表明本研究分离获得了目的基因 St H2A-1 c DNA。用 St H2A-1 c DNA 预测的氨基酸序列检索 Uniprot 和马铃薯基因组数据库, 识别了 3 个 St H2A-1 同源序列, 其中, DMP400034947 (Uni Prot KB-M1BSE4) 与 St H2A-1 氨基酸序列相似性 100%, 其编码基因 ID 为 DMG401020138;另 2 个同源序列 DMP400001984 和 DMP400033537 (Uni Prot KB-M1BP63 和
29、 Uni Prot KB-M0ZKK1) 与 St H2A-1 氨基酸序列相似性分别是 95%和 88%, 基因 ID 分别为DMG400019306 和 DMG400001065。用 St H2A-1 序列检索本氏烟基因组和 Uniprot 数据库, 识别了 22 个本氏烟 Nb H2A 氨基酸序列, 用 Clustal Omega 软件构建其进化树, 结果如图 1A 所示, Nb H2A 进化形成了 4 clades, 其中 clade 1 和 clade 2 更为保守, C3-3 包含 5 个与 St H2A-1 序列相似性高于 97%的 Nb H2As。2.1.2 St H2A-1 同
30、源序列比对St H2A-1 序列检索 Uniprot 数据库, 识别了人类 (Homo sapiens) H2A.Z (Gen Bank:CR457415, 相似性 96%) 、拟南芥 H2A (AT3G54560) 成员 HTA11 (相似性91.2%) , 用这些序列与本氏烟 C3-3 clade 的 5 个 Nb H2A 和上述 3 个马铃薯St H2A 序列进行比对, 结果如图 1B 所示, 虽然来源不同, 但与 St H2A-1 序列相似的 H2A 具有高度保守的 DNA 结合结构域, 马铃薯和本氏烟的这些 H2A 均具有 N 端多聚丙氨酸基序, 这是其区别于本氏烟其他 Nb H2A
31、 和不同物种 H2A 的显著组成特征。图 1B 所示的 St H2A、Nb H2A 与人类 H2A.Z 氨基酸序列高度相似, 显示了其进化的保守性, 同时, 这也使得用人源 H2A ELISA 试剂盒测定 Nb H2A 含量成为可能。2.1.3 Nb H2A 积累减少抑制生长发育H2A-F/R 引物 RT-PCR 产物和 p C-35S 载体 DNA 酶切和连接后, 获得重组质粒 p C-St H2A-1, p C-St H2A-1 重组质粒 DNA 的 Sac (6) 和 Bam H (6) 双酶切结果如图 2A 所示, 酶切重组质粒释放了预期大小的片段, 测序结果证实了 St H2A-1
32、c DNA 按预期的反向 (35) 连接于 35S 启动子 3端, 获得了重组质粒p C-St H2A-1 和相应重组菌株 DH5-St H2A-1 及 GV3101-St H2A-1, 用 GV3101-St H2A-1 侵染本氏烟叶盘外植体, 筛选获得 PCR 阳性株系。图 1 Nb H2A 进化树及不同来源 H2A 氨基酸序列比对 Figure 1 Phylogeny tree and multiple amino acid sequence alignment of Nb H2AB.不同来源 St H2A-1 相似 H2A 序列比对结果。H2AZ_HUMAN:P0C0S5 蛋白质;At
33、3g54560:拟南芥 H2A 基因 HTA11;Niben14012、Niben01014、Niben08001、Niben03001和 Niben00009 分别是Niben101Scf06708g02012、Niben101Scf16915g0101、Niben101Scf12159g08001、Niben101Scf08328g00009 和 Niben101Scf00104g03001 的缩写 A.Phylogeny tree of 22 Nb H2As.Red box:Primers names;B.Multiple amino acid sequence alignment of
34、 different sources.H2A.H2AZ_HUMAN:P0C0S5 protein;At3g54560:At HTA11;Niben14012, Niben01014, Niben08001, Niben0300 and Niben00009:The abbreviation of Niben101Scf06708g02012, Niben101Scf16915g0101, Niben101Scf12159g08001, Niben101Scf08328g00009 and Niben101Scf00104g03001, respectively图 2 重组载体 p C-St H
35、2A-1 酶切 (A) 及转化株系 GUS 染色 (B) 结果 Figure 2 Enzyme digestion of recombinant vector p C-St H2A-1 (A) M2:15 kb DNA Marker;1:St H2A-1 片段;2:p C-35S 载体 Sac (6) 和 Bam H (6) 双酶切产物;36:p C-St H2A-1 重组载体 Sac (6) 和 Bam H (6) 双酶切产物。M1:DNA marker DL2000;M2:DNA marker DL15000 1:St H2A-1 fragment;2:Fragments of p C-3
36、5S digested by Sac (6) and Bam H (6) :36:Fragments of recombinant vector p C-St H2A-1 digested by Sac (6) and Bam H (6) 图 3 Nb H2A 蛋白表达测定结果 (A) 及 h2a-1 株系表型 (B) Figure 3 Nb H2A protein contents assayed by ELISA (A) and the phenotype of h2a-1 line (B) 下载原图*:野生型 (WT) 组蛋白 H2A.Z 含量显著高于 h2a-1 突变体 (P0.05)
37、 ;下同*:H2A content in the wild type (WT) is significantly higher than the h2a-1 mutant (P0.05) ;The same below对 PCR 阳性株系根系样品进行 GUS 染色, 筛选获得 GUS 阳性独立株系 4 株, 其中 1 株 GUS 染色如图 2B 所示, 4 个株系均表现不同程度的顶端优势缺失和成花推迟;H2A.Z 含量 ELISA 测定数据 t 检验结果如表 3 所示, 其中, h2a-1 株系叶片 H2A.Z 蛋白质含量 1.030.50g/m L, 显著低于 WT 株系 1.350.54g
38、/m L (P0.05) , h2a-1 株系叶片 H2A.Z 蛋白质含量比 WT 减少了 31%, 依此确定h2a-1 株系作为 Nb H2A 抑制表达株系, 进行其后的测定和分析。h2a-1 株系叶片 H2A 蛋白质含量测定分析结果及其表型分别如图 3A 和 B 所示, h2a-1 株系表现顶端优势缺失、生长迟缓和开花时间推迟的表型, 表型观察结果表明, 减少Nb H2A 积累抑制了本氏烟生长和发育。2.2 Nb H2A 积累减少伴随其他 Nb H2A 上调表达为了确定反义 St H2A-1 本氏烟体内表达对不同 Nb H2A 的抑制, 依据 2.1.2 序列比对结果, 设计了 4 对可区
39、别 3 个 clades 的特异引物, 正向和反向引物尽可能覆盖了进化关系接近的 Nb H2A 成员, 引物名称及引物所在基因 DNA 序列位置对应的 Nb H2A 氨基酸序列位置如图 4 所示。WT 叶片 m RNA 样品 915 引物 RT-PCR 扩增产物信号明显强于 h2a-1 样品 (图 5) , 也即 h2a-1 样品 Nb H2A-1 m RNA 积累减少, 表明反义 St H2A-1 c D-NA 本氏烟体内表达, 因其产生反义 m RNA 与 Nb H2A-1 正义 m RNA 互补, 从而减少了h2a-1 中 C3-3 所含 Nb H2As 的 m RNA 积累;h2a-1
40、 中 C3-3 所含 Nb H2As 的 m RNA 积累减少和 Nb H2A 蛋白含量下降的结果 (图 3A) 表明, 反义 St H2A-1 抑制了 C3-3 所含 5 个 Nb H2As 的 m RNA 积累, 致使其翻译产物 Nb H2A 减少。如图 5 所示, 以 h2a-1 株系 m RNA 为模板, 用 676 和 867 引物 RT-PCR 扩增产物明显多于 WT, 表明在 h2a-1 株系中, 与 676 和 867 引物可以序列互补的 Nb H2As 基因随 C3-3 所含 5 个 Nb H2As 的 m RNA 积累减少而增加 m RNA 积累;如图1A 和图 4 所示,
41、 引物 676 和 867 覆盖了来自 C3-2 中的 6 个 Nb H2A 基因;以上结果表明, 当 C3-3 所含 5 个 Nb H2A 基因 m RNA 积累减少时, C3-2 中 6 个 Nb H2A 基因 m RNA 积累上调, 以互补或替代 C3-3 中 5 个 Nb H2As 表达的减少。图 4 Nb H2A 引物名称及引物所在基因 DNA 序列位置对应的氨基酸序列位置Figure 4 Nb H2A primers and its corresponding amino acid sequences site 下载原图红框:基因引物名称和位置;绿框:多聚丙氨酸基序 Red box
42、:Primers and its corresponding site;Green box:Poly alanine motif表 3 本氏烟 4 个转化株系叶片 H2A.Z 蛋白质含量 t-检验 Table 3 Leaf H2A.Z contents of 4 transgenic lines by t-test 下载原表 引物 374 扩增产物胶电泳显示, WT 和 h2a-1 株系两者间没有明显可见的产物胶电泳信号强度的区别, 表明来自 C3-1 的至少 3 个 Nb H2As 基因的表达, 并未随C3-3 的 5 个 Nb H2As 表达减少而变化, 引物 962 得到和引物 374
43、同样的结果 (结果未显示) ;结果表明, 进化中保守的 Nb H2A 基因 Clada 1、Clada 2 和C3-1 并不伴随 C3-3 中 Nb H2As 基因表达的减少而改变。2.3 Nb H2A 下调表达抑制成花基因 CO、FT 和 EIF4 表达开花推迟是 Nb H2A 抑制株系异于 WT 的显著表型之一, 为了确定其推迟开花的原因, 结合植物开花机制研究进展 (Engineer et al., 2014) , 本研究检索本氏烟草基因组中成花基因 c DNA 序列, 依据各家族序列比对结果, 设计了功能已确认基因的特异引物, 引物名称及序列如表 2 所示;WT 和 h2a-1 叶片
44、m RNA为模板的 RT-PCR 产物胶电泳结果如图 6 所示, 4 个 ELF4 基因特异引物中, 除了引物 4003 在 WT 和 h2a-1 m RNA 模板间无明显可见的扩增产物信号的区别, 其他 4 对引物 7011、2011 和 2012 以野生型和 h2a-1 m RNA 为模板 RT-PCR, 获得了预期大小产物, 野生型 m RNA 为模板的扩增产物电泳条带信号明显强于以h2a-1 m RNA 模板扩增的对应产物, 表明 Nb H2A 积累减少, 抑制了 3 个 ELF4基因 Niben101Scf04044g17011、Niben101Scf06708g02011 和Nib
45、en101Scf06708g02012 的 m RNA 积累。图 5 WT 和 h2a-1 中不同 Nb H2A 基因 m RNA 积累 RT-PCR 结果 Figure 5 RT-PCR result of m RNA accumulations of different Nb H2A genes in WT389:内标基因 EF1 特异引物;374:C3-1;676 和876:C3-2;915:C3-3 包含基因的特异引物;h2a:h2a-1 的缩写 M:DNA marker DL2000;389:Primer for reference gene EF1s;374:Primer for
46、C3-1;676 and 876:Primer for C3-2;915:Primer for C3-3;h2a:The abbreviation of h2a-1 transgenic lines图 6 成花基因在 h2a-1 和对照 (WT) 株系中表达的 RT-PCR 结果 Figure 6 RT-PCR result of floral genes expressing in WT389:内标基因 EF1 特异引物;4003、7011、2011 和2012:4 个 ELF4 基因的特异引物;3007 和 0008:分别为 CO 和 FT 基因的特异引物;WT:非转化野生型株系;h2a:
47、转化株系 h2a-1 的缩写 M:DNA marker DL2000;389:Reference gene EF1primers;4003, 7011, 2011 and 2012:Four ELF4 gene primers;3007 and0008:The primers of CO and FT genes, respectively.WT:Wild type strains;h2a:The abbreviation of h2a-1 transgenic strain特异 3007 引物 RT-PCR 获得了来自 WT 和 h2a-1 样品的预期大小产物, 但 h2a-1株系 m RNA 为模板的 3007 引物扩增产物明显低于 WT 的 m RNA 模板, 显示了下调 Nb H2A 蛋白积累, 抑制了 CO 基因 Niben101Scf02210g03007 的 m RNA 积累;对照株系中 0008 引物 RT-PCR 产物明显可见, 而 h2a-1 株系中未检出 0008 引物
