1、TBX2 基因沉默抑制卵巢癌细胞增殖同时促进细胞衰老发生摘 要 ： 卵 巢 癌 已 成 为 致 死 率 最 高 的 妇 科 恶 性 肿 瘤 , 缺 乏 特 异 性 分 子 靶 点 是 引 起 其 高 致 死 率 的 重 要 因 素 之 一 .TBX 2 是 发 育 相 关 转 录 因 子 T- box 基 因 家 族 成 员 之 一 ， 已 证 实 其 在 黑 色 素 瘤 等 多 种 肿 瘤 中 异 常 表 达 . 本 实 验 通过 免 疫 组 化 检 测 了 人 良 性 卵 巢 囊 肿 组 织 与 卵 巢 癌 组 织 中 TBX 2 蛋 白 表 达 ， 并 采 用 CCK 8 法 、 克 隆
2、 形 成 实 验 、 SA- - Gal 染 色 等 方 法 ， 分 析 了 在 卵 巢 癌 细 胞 中 敲 低 TBX 2 后 对 细 胞 增 殖 和 衰 老 的 影 响 . 结 果 表 明 TBX 2 在 卵 巢 癌 组织 中 高 表 达 ， 同 时 TBX 2 基 因 沉 默 抑 制 了 卵 巢 癌 细 胞 增 殖 和 克 隆 形 成 ， 诱 导 了 P 21WAF 1和 P 16INK 4 A表 达 上 调 ， 促 进了细胞衰老发生 .关键词 ： TBX 2 ； 卵巢癌 ； 细胞衰老 ； 细胞增殖中图分类号 ：R 737. 31 文献标识码：A0 引 言卵巢 癌是 致死 率最 高的 妇
3、科 肿瘤 ， 且发 病率 逐年 增加 . 目前 卵巢 癌治 疗主 要依 赖于 手术 切除 和药 物化疗 ， 且病人 诊断时 多已是 晚期 ， 常伴随 腹腔转 移 ， 造成手 术预后 较差 1 ， 长期化 疗易引 起耐药 性 ， 这些方 法的5 年生存率偏低 2 . 因此寻找卵巢癌相关的特异性 分子靶点具有重要的临床价值 .T-box 基因家族是一类重要 的 发 育 相 关 的 转 录 因 子 ， 其 中 高 度 同 源 的 TBX 2 和 TBX 3 具 有 保 守 的 DNA 结 构 域 ， 均 参 与 胚 胎 发 育 3 和癌 症 发 生 过 程 4 .TBX 2 在 四 肢 、 乳 腺
4、、 肺 、 心 脏 、 眼 和 肾 脏 发 育 中 起 关 键 作 用 5 .TBX 2 异 常 表 达 与 许 多 恶 性肿 瘤 的 发 生 发 展 相 关 ， 如 横 纹 肌 肉 瘤 中 TBX 2 与 肌 形 成 调 节 因 子 肌 红 蛋 白 和 肌 细 胞 生 成 素 相 互 作 用 ， 促 进了 细 胞 增 殖 6 ， 乳 腺 癌 中 TBX 2 抑 制 CDKN 2 A(P 14ARF) 表 达 阻 断 了 衰 老 途 径 发 生 7 ， 黑 色 素 瘤 中 TBX 2 发 挥促 增 殖 抑 制 衰 老 功 能 8 ， 临 床 上 TBX 2 高 表 达 可 作 为 诊 断 结
5、直 肠 癌 预 后 不 良 的 分 子 标 记 9 . 人 类 TBX 2 基 因定 位 于 17q 23 ， 基 因 组 学 分 析 发 现 卵 巢 癌 在 该 区 域 频 繁 发 生 突 变 10 ， 此 外 TBX 2 是 与 卵 巢 癌 肿 瘤 分 期 相 关重要 的候 选基 因之 一 11 . 然而 TBX 2 参与 卵巢 癌发 生发 展的 过程 及相 关调 节机 制尚 不明 确 . 本实 验研 究了TBX 2 基因沉默对卵巢癌细胞增殖和衰老的影响 ， 为卵巢癌诊断和治疗提供新思路 .1 材料与方法1.1 主要试剂慢 病 毒 载 体 pLKO. 1- TRC ， PAX 8， pVS
6、VG 质 粒 由 天 津 医 科 大 学 吴 旭 东 教 授 惠 赠 ； AgeI 、 EcoRI 、NcoI 、 T 4 DNA 连 接 酶 购 自 NEB 公 司 ； Trans 2 K Plus II DNA marker 购 自 全 式 金 公 司 ， 100 U/mL 青 霉素 、 100 mg/L 链 霉 素 、 胎 牛 血 清 、 胰 蛋 白 酶 购 自 BI 公 司 ， 转 染 试 剂 PEI 购 自 Polysciences 公 司 ， TRIzol 购 自Ambion 公 司 ， Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 、
7、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox) 购 自 Roche 公 司 ， McCoys 5 A Medium 、 嘌 呤 霉 素 、 PMSF 、 NaF 、 4 % PFA 、 结 晶 紫 购 自 Sigma 公 司 ，DMEM 购 自 Gibco 公 司 ， 一 抗 TBX 2 （ 07 - 318 ） 购 自 Miliipore 公 司 ， P 21 /WAF 1 （ WL 0362 ） 、 CDKN 2 A/P 16 INK 4A （ WL 01418 ） 购 自 万 类 生 物 科 技 有 限 公 司 ， - Actin 、 - Tubl
8、in 购 自 Santa Cruz Biotechnology 公司 ， 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 抗 鼠 源 IgG 二 抗 （ 074- 1806 ） 、 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 抗 兔 源 IgG 二 抗 （ 074 -收稿日期：2016 - 10 - 10基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 31371329 ); 天 津 市 应 用 基 础 与 前 沿 技 术 研 究 计 划 ( 13JCYBJC 37200 ); 高 等 学 校 博 士 学 科点专项科研基金( 20131202120011 )作者简介：张 雁( 1990- ) ， 女
9、 ， 河南信阳人， 硕士研究生 .通 讯 作 者 ： 赵 丽 ( 1977- ) ， 女 ， 天 津 人 ， 博 士 ， 教 授 ， 研 究 方 向 ： 神 经 系 统 发 育 与 发 育 型 疾 病 及 癌 症 发 生 . E- mail: sh -张 雁等 ： TBX 2 基因沉默抑制卵巢癌细胞增殖同时促进细胞衰老发生第 3 期 张 雁等：TBX 2 基因沉默抑制卵巢癌细胞增殖同时促进细胞衰老发生 61 1506 ） 购 自 KPL 公 司 ， 脱 脂 奶 粉 购 自 BD 公 司 ， BCA 蛋 白 定 量 试 剂 盒 购 自 Pierce 公 司 ， RIPA 蛋 白 裂 解 液 、
10、细胞 衰 老 - 半 乳 糖 苷 酶 染 色 试 剂 盒 购 自 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司 ， CCK 8 试 剂 盒 购 自 日 本 同 仁 化 学 科 技 有限 公 司 ， 兔 SP 试 剂 盒 、 DAB 显 色 液 、 枸 橼 酸 钠 购 自 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ， H 2 O 2 、 乙 醇 、 甲 醇 、 氯仿 、 二甲苯购自天津市化学试剂六厂 .1.2 卵巢癌组织切片人良性卵巢囊肿组织和人卵巢癌组织切片由天津市中心妇产科医院病理科提供 .1.3 细胞培养卵 巢 癌 SKOV 3 细 胞 、 293 T 细 胞 为 本 实 验
11、室 保 存 。 SKOV 3 细 胞 培 养 条 件 为 10 % 胎 牛 血 清 、 100 U/mL 青 霉 素 、 100 mg/L 链 霉 素 的 McCoys 5A 培 养 基 ， 293 T 细 胞 培 养 条 件 为 10 % 胎 牛 血 清 的 DMEM 培 养基， 均置于 37 含 5 %CO 2 的细胞孵箱中培养 ， 含 0 . 25 %EDTA 的胰酶消化细胞 ， 48 - 72 h 传代 1 次 .1.4pLKO.1-shTBX2 重组质粒构建经 生 物 信 息 学 分 析 ， 实 验 合 成 的 人 T B X 2 的 s h R N A 序 列 为 s h R N
12、A - 1 ： 5 - C C G G G C C G C T A T A -A G T T C C A C A A C T C T C G A G A G T T G T G G A A C T T A T A G C G G C T T T T T G - 3 ; 5 - A A T T C A A A A A G CCGCTATAAGTTCCACAACTCTCGAGAGTTGTGGAACTTATAGCGGC- 3 ; shRNA- 2 : 5- CC -GGGCACGGCTTCACCATCCTAAACTCGAGTTTAGGATGGTGAAGCCGTGCTTTTTG- 3 ; 5 -AA
13、TT CA AA AA GC AC GG CT TC AC CA TC CT AA AC TC GA GT TT AG GA TG GT GA AG CCG TG C- 3 .根据 A d d g e n e 中 p L K O . 1 - T R C 克隆载体方 法构建 p L K O . 1 - s h T B X 2 重组质粒 . 酶切鉴定且 测序正确后 质粒分别命名为 pLKO. 1-shTBX 2 - 1 、 pLKO. 1 -shTBX 2 - 2 .1.5shTBX2 的慢病毒包装 、 卵巢癌细胞感染和筛选配 制 转 染 混 合 液 ： 800 L Opti- MEM 溶 液 溶
14、 解 PAX 8 质 粒 3 . 5 g 、 pVSVG 质 粒 6 . 5 g 、 pLKO. 1-shTBX 2 - 1 （ 或 pLKO. 1- shTBX 2 - 2 或 对 照 质 粒 pLKO. 1 ） 10 g 、 转 染 试 剂 PEI 80 L ， 轻 轻 混 匀 ， 室 温 静置 20 min 后 ， 将 混 合 液 转 染 处 于 培 养 对 数 期 的 293 T 细 胞 中 ， 转 染 6 - 8 h 后 将 细 胞 换 液 ， 培 养 48- 72 h 后收 集 病 毒 上 清 . 病 毒 感 染 处 于 对 数 期 的 SKOV 3 细 胞 ， 感 染 前 将 培
15、 养 基 更 换 为 含 10 g/mL polybrene 的 新鲜 培 养 基 ， 感 染 48 h 后 将 培 养 基 换 为 含 2 g/mL 嘌 呤 霉 素 的 培 养 基 , 每 隔 2 d 更 换 一 次 含 2 g/mL 嘌 呤霉素的培养基 ， 待形成克隆后挑选克隆集落扩大培养 ， 以半剂量嘌呤霉素继续培养进行稳定筛选 .1.6RT-PCR 检测mRNA 表达水平TRIzol 法 提 取 样 本 总 RNA ， 按 照 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 进 行 cDNA 逆 转 录 ，以 - Actin 作 为 内 参 ，
16、 采 用 Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox) 进 行 荧 光 定 量 PCR 扩 增 . -Actin 的 上 游 引 物 ： 5 - CACCATTGGC- AATGAGCGGTTC- 3 ； 下 游 引 物 ： 5 - AGGTCTTTGCG -GATGTCCACGT- 3 . TBX 2 的 上 游 引 物 ： 5 - AGCAGTGGATGGCTAAGCCTGT- 3 ； 下 游 引 物 ：5 - GGA- TGTCGTTGGCTCGCACTAT- 3 . P 21WAF 1的 上 游 引 物 ： 5- AGGTGGACCTGGAGA
17、 -CTCTCAG- 3 ； 下 游 引 物 ： 5 - TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG- 3. P 16INK 4 A的 上 游 引 物 ： 5 - ATG -GAGCCTTCGGCTGACT- 3 ； 下 游 引 物 5 - GTAACTATTCGG- TGCGTTGGG- 3 .PCR 反 应 体 系20 L ， 反 应 条 件 ： 预 变 性 95 2 min, 变 性 95 15 s, 退 火 60 30 s, 共 40 个 循 环 . 运 用 ABI 7500SDS V 1. 4 软件分析 ， 采取 2- CT法进行数据相对定量 .1.7Westernblot 检测蛋
18、白表达变化RIPA 裂 解 液 抽 提 蛋 白 ， BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度 。 采 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 进 行 电 泳 ， 电 泳 后 湿 转 至 0 . 45 m PVDF 膜 上 ， 5 % 脱 脂 牛 奶 封 闭 2 h, 4 过 夜 孵 育 一 抗 ， TBST 洗 膜 ( 3 次 ， 10 min/ 次 ) ， 选 择 与 一 抗 来 源相同的 HRP 标记的 IgG 二抗室温孵育 1 . 5 h, TBST 洗膜 （ 3 次 ， 10 min/ 次 ） , 胶片曝光 ， 显影定影 .1.8 细胞增殖检测2 103个/ 孔 细 胞 接 种 于 96 孔 板 内
19、 ， 每 组 实 验 设 置 4 个 重 复 孔 ， 以 细 胞 贴 壁 8 h 后 记 为 0 d ， 连 续 培 养 5d, 按 照 每 孔 100 L 培 养 基 加 入 10 L CCK 8 试 剂 ， 在 37 含 5 % CO 2 细 胞 培 养 箱 孵 育 4 h ， 酶 标 仪 450 62 南 开 大 学 学 报 （ 自然科学版 ） 第 50 卷nm 读取吸光值 .1.9 克隆形成细 胞 经 胰 酶 消 化 后 制 成 单 细 胞 悬 液 ， 以 2 x103个/ 皿 接 种 于 60 mm 细 胞 培 养 皿 中 ， 置 于 37 含 5%CO 2 的 细 胞 孵 箱 中
20、培 养 培 养 14 d 后 ， 弃 培 养 基 ， PBS 漂 洗 （ 3 次 ， 3 min/ 次 ） ， 4 % PFA 固 定 20 min ， 2 % 结 晶紫染色 15 min ， 弃染色液后蒸馏水漂洗 ， 拍照并进行克隆计数 ， 以细胞数目大于 50 个视为一个克隆 .1.10SA- -Gal 检测细胞衰老细 胞 以 3 104个/ 孔 接 种 于 6 孔 板 中 , 0. 5% 低 浓 度 血 清 饥 饿 处 理 5 d, 弃 培 养 基 ,PBS 漂 洗 （ 3 次 ， 3 min/次 ） ， 按 照 细 胞 衰 老 - 半 乳 糖 苷 酶 染 色 试 剂 盒 进 行 操 作
21、 ， 加 入 固 定 液 ， 室 温 固 定 15 min ， 移 除 固 定 液 ， PBS漂 洗 （ 3 次 ， 3 min/ 次 ） ， 配 制 染 色 液 ， 37 过 夜 孵 育 （ 注 意 保 证 染 色 液 pH 6. 0 左 右 ， 且 不 可 在 含 5 % CO 2 的培 养 箱 中 进 行 染 色 孵 育 ） ， 去 除 染 色 液 ， 加 入 PBS 2 mL/ 孔 ， 镜 检 拍 照 ， 对 阳 性 细 胞 计 数 ， 以 细 胞 质 中 出 现蓝色颗粒为阳性 .1.11 免疫组化61 烤 片 1 . 5 h ， 冷 却 至 室 温 后 经 二 甲 苯 2 次 ， 梯
22、 度 乙 醇 脱 蜡 处 理 各 5 min/ 次 ， 蒸 馏 水 漂 洗 5 min, 切片 置 于 0. 01 mol/L 枸 橼 酸 钠 缓 冲 溶 液 （ pH 6 . 0 ） 中 进 行 抗 原 修 复 ， 95 - 100 20 min ， 室 温 冷 却 1 h, 蒸 馏水 漂 洗 5 min ， 3 % H 2 O 2 避 光 15 min ， 蒸 馏 水 漂 洗 5 min ， PBS 漂 洗 （ 2 次 ， 5 min/ 次 ） ， 5 % 羊 血 清 室 温 封 闭 1h， 弃 封 闭 液 ， 加 入 120 L - TBX 2 一 抗 （ 1 : 400 ） ， 4 孵
23、 育 过 夜 ， PBST 漂 洗 （ 3 次 ， 5 min/ 次 ） ， 加 入 120 L 二 抗 室 温 孵 育 30 min ， PBST 漂 洗 （ 3 次 ， 5 min/ 次 ） ， 加 入 150 L 3 抗 室 温 孵 育 30 min ， PBST 漂 洗 （ 3次 ， 5 min/ 次 ） ， DAB 显 色 ， 滴 加 ddH 2 O 终 止 显 色 ， 苏 木 精 复 染20 s ， 自 来 水 终 止 显 色 ， 经 梯 度 乙 醇 脱 水 ， 二 甲 苯 透 明 ， 各 5 min/次， 中性树脂封片 ， 镜检拍照 .1.12 统计学方法各 组 数 据 以 均
24、数 标 准 差 （ mean SD ） 表 示 ， 使 用 SPSS13. 0 软 件 对 数 据 进 行 分 析 ， 两 组 间 比 较 采 用 t 检 验 ， 以 P 0. 05 为差异有统计学意义 .2 结 果2.1TBX2 在人卵巢癌组织中的表达通 过 免 疫 组 化 染 色 发 现 ， 与 人 良 性 卵 巢 囊 肿 组 织 （ n = 2 ） 相比 ， 人 卵 巢 癌 组 织 中 TBX 2 表 达 明 显 上 调 （ n = 10 ） ， 如 图 1 所 示 .说明 TBX 2 可能在促进卵巢癌恶化转变过程中发挥功能 .2.2 卵巢癌细胞TBX2 敲低细胞系构建为 进 一 步 探
25、 究 TBX 2 调 控 卵 巢 癌 发 生 发 展 的 相 关 分 子 机理 ， 本 实 验 构 建 了 pLKO. 1 - shTBX 2 慢 病 毒 质 粒 并 感 染 卵 巢 癌SKOV 3 细 胞 ， 筛 选 获 得 TBX 2 稳 定 敲 低 细 胞 系 . 通 过 RT- PCR 和 Western blot 实 验 检 测 TBX 2 表 达 变 化 ，与 对 照 组 相 比 ， 卵 巢 癌 SKOV 3 细 胞 感 染 pLKO. 1- shTBX 2 后 TBX 2 的 mRNA 和 蛋 白 表 达 显 著 降 低 . 如 图2 所示 .2.3TBX2 功能缺失抑制卵巢癌细
26、胞增殖为了分析 TBX 2 敲低后对 SKOV 3 细胞增殖的影响 ， 本实验采用 CCK 8 法和克隆形成实验进行检测 . 结果 表 明 ， 细 胞 贴 壁 后 1 、 2 、 3 、 4 d 细 胞 增 殖 显 著 减 慢 ， 且 14 d 时 克 隆 形 成 数 目 和 体 积 均 减 少 . 如 图 3 所 示 . 表明 TBX 2 功能缺失后抑制卵巢癌细胞的增殖和克隆形成 .100 400BAC图 A 为人良性卵巢囊肿组织，图 B 、 C 为人卵巢癌组织图1 免疫组化检测人卵巢癌组织中TBX2 表达水平Fig.1ImmunohistochemistryforTBX2expressio
27、ninhumanovariantissues第 3 期 张 雁等：TBX 2 基因沉默抑制卵巢癌细胞增殖同时促进细胞衰老发生 63 2.4TBX2 沉默促进卵巢癌细胞衰老为 了 检 测 TBX 2 敲 低 后 对 SKOV 3 细 胞 衰 老 的影 响 ， 本 实 验 构 建 了 细 胞 饥 饿 衰 老 模 型 . 通 过 SA- - gal 染 色 发 现 ， TBX 2 基 因 沉 默 后 卵 巢 癌 SKOV 3细 胞 形 态 学 上 明 显 变 得 大 而 扁 平 ， 且 染 色 阳 性 率 显著 提 高 . 同 时 TBX 2 沉 默 后 ,RT- PCR 和 Westernblot
28、 检 测 发 现 促 衰 老 相 关 基 因 P 21WAF 1和 P 16INK 4 A表达 上 调 . 这 些 结 果 说 明 TBX 2 基 因 沉 默 促 进 卵 巢 癌细胞衰老发生 . 如图 4 所示 .3 讨 论通 过 免 疫 组 化 结 果 发 现 TBX 2 在 卵 巢 癌 组 织中 表 达 异 常 增 加 ， 说 明 TBX 2 可 能 在 促 进 卵 巢 癌 恶化 过 程 中 发 挥 功 能 . 为 深 入 研 究 TBX 2 调 节 卵 巢 癌 发 生发 展 相 关 分 子 机 制 ， 构 建 了 TBX 2 稳 定 敲 低 的 卵 巢 癌 细胞 系 ， 细 胞 表 型
29、实 验 结 果 显 示 ， TBX 2 基 因 沉 默 后 卵 巢 癌细 胞 形 态 上 发 生 明 显 变 化 , 如 细 胞 变 得 扁 平 ， 体 积 增 大 ，代 谢 上 伴 随 着 溶 酶 体 活 性 （ SA- - gal ） 升 高 ， 而 - 半 乳糖 苷 酶 活 性 增 强 是 细 胞 衰 老 最 典 型 的 标 志 12 . 同 时 ，CCK 8 法 和 克 隆 形 成 实 验 发 现 TBX 2 基 因 沉 默 后 细 胞 增殖 变 慢 且 活 力 降 低 ， 说 明 TBX 2 在 促 进 卵 巢 癌 细 胞 衰 老过程中发挥重要功能 .为进 一步 了解 TBX 2 促
30、进 卵巢 癌细 胞衰 老的 相关 机理 ， 我 们 检 测 了 TBX 2 基 因 沉 默 的 细 胞 和 对 照 组 细胞 之 间 衰 老 相 关 基 因 的 表 达 差 异 ， 结 果 显 示 TBX 2基 因 沉 默 诱 导 了 P 21WAF 1和 P 16INK 4 A表 达 上 调 . 我 们知 道 众 多 信 号 通 路 参 与 调 控 细 胞 衰 老 ， 而 影 响 其 功能 的 关 键 基 因 有 抑 癌 基 因 P 53 和 抑 制 细 胞 周 期 相关 基 因 CD KN 2 A （ 编 码 蛋 白 P 16INK 4 A和 P 14ARF） 、CDKN 2B （ 编 码
31、 蛋 白 P 15INK 4 B） 、 CDKN 1A （ 编 码 蛋 白P 21WAF 1） 、 CDKN 1B （ 编 码 蛋 白 P 27 ） ， 上 述 细 胞 周 期蛋 白 异 常 表 达 可 引 起 细 胞 增 殖 停 滞 ， 同 时 是 参 与RB 家 族 执 行 衰 老 功 能 的 关 键 组 分 13.P 16INK 4 A抑 制CDK 4 和 CDK 6 蛋 白 活 性 , 阻 断 了 CDK 4 /CDK 6 与Cyclin D 形 成 复 合 物 ， 进 而 抑 制 RB 蛋 白 磷 酸 化 ， 引发 细 胞 衰 老 14 . 研 究 表 明 TBX 2 参 与 发 育
32、 过 程 转 录调 控 15 ， 且 在 衰 老 细 胞 中 表 达 下 调 16， 说 明 TBX 2 可能 在 发 育 阶 段 的 程 序 性 衰 老 中 执 行 关 键 功 能 . 综 上所 述 ， TBX 2 可 以 作 为 卵 巢 癌 诊 断 和 治 疗 过 程 中 新的潜在靶点进行深入探究 .shCtrl sh TBX 2 - 1 sh TBX 2 - 2 shCtrl sh TBX 2 - 1 sh TBX 2 - 20. 00. 20. 40. 60. 81. 01. 2TBX 2* -Tublina relative level of TBX 2 mRNAA:TBX 2 mR
33、NA 的相对表达量 B ： TBX 2 蛋白水平变化情况图 B 中* 表示非特异条带， RT-PCR 内参为 -Actin, Westernblot 内参为 -Tublin, 图 A 中 * 表示 P 0. 01图2 卵巢癌SKOV3 细胞感染pLKO.1-shTBX2 后mRNA 和蛋白水平检测Fig.2SKOV3celllinesexpressingshRNAconstructsagainstTBX2orthescrambledcontrol(shCtrl)wereassayedbyRT-PCRandWesternblot0. 00. 51. 01. 52 . 02 . 5shCtrlsh
34、 TBX 22 5 3 4 1 0time/dshCtrl sh TBX 2OD 450A ： CCK 8 法测定细胞增殖速率 B: 结晶紫染色法分析克隆形成图 A 中 * 表示 P 0 . 05， * 表示 P 0 . 01图3TBX2 功能缺失抑制卵巢癌细胞增殖和克隆形成Fig.3Knock-downofTBX2inhibitsovariancancercellproliferationandcolonyformationshCtrl23410shCtrlsh TBX 2A Bsh TBX 2shCtrlsh TBX 2sh TBX 2 shCtrl020406080 -Actina re
35、lative level ofTBX 2 mRNACDTBX 2P 21WAF 1P 16INK 4 AP 21WAF 1P 16INK 4 ASA- -Galpositive cell/%图 A 、 B 为 卵 巢 癌 S K O V 3 细 胞 T B X 2 基 因 沉 默 后 细 胞 衰 老 相 关 -半乳 糖苷 酶染 色以 及其 阳性 率 ， 图 C 、 D 为 S K O V 3 细胞 T B X 2 基因 沉 默 后 P 2 1W A F 1和 P 1 6I N K 4 A的 m R N A 和 蛋 白 表 达 变 化 ， 图 D 中 * 表示 非 特 异 条 带 ， R T -
36、 P C R 内 参 为 - A c t i n , W e s t e r n b l o t 内 参 为 -Actin ， 图 B 和图 C 中* 表示 P 0 . 05， * 表示 P 0 . 01图4TBX2 沉默促进卵巢癌细胞衰老发生Fig.4SilencingTBX2promotesovariancancercellsenescence 64 南 开 大 学 学 报 （ 自然科学版 ） 第 50 卷参 考 文 献1 Yeung T L, Leung C S, Yip K P, et al. Cellular and molecular processes in ovarian ca
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48、emistry and Molecular Biology , Tianjin Medical University , Tianjin 300070 , China )Abstract: Ovarian cancer is the most lethal malignant gynecological tumor and the absence of specificmolecular targets is one of the key factors. TBX 2 belongs to the developmentally related T- box family oftranscri
49、ption factors and has been confirmed abnormal expression in several cancers such as melanoma. In第 3 期 张 雁等：TBX 2 基因沉默抑制卵巢癌细胞增殖同时促进细胞衰老发生 65 this study, we detected TBX 2 protein expression between benign tumor tissues and malignant ovarian can -cer tissues by IHC. Then, We constructed TBX 2 stably k
50、nocked down ovarian cancer cell lines by RNAitechnique. Subsequently, cell proliferation were analyzed by CCK 8 assay and colony forming ability inTBX 2 gene silencing cells. cellular senescence were detected by SA- - galactosidase staining and the differ -ential expression of typical senescence- as
