1、DNA重组技术,李信民遗传学与分子生物学系,DNA重组 克隆,DNA重组不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组。克隆指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体的过程叫做克隆化。重组DNA技术也叫基因工程。,第一节 工具酶,工具酶： 对目的基因进行切割，合成，连接，修饰的酶 主要有 限制酶和修饰酶两类,一限制性内切酶 restriction endonuclease,限制酶的命名：四个字母+罗马数字第一个字母：大写 表示该菌的属名第二、三个字母：小写 表示该菌的种名第四个字母：（有时无） 表示该菌的株名罗马数字：酶的
2、编号（按发现的顺序）,限制酶的种类 属DNA内切酶类，均来源于细菌，分三型 在DNA重组中用II型，该酶特点是：有特异识别位点,限制酶的识别位点通常是4-6个碱基对，具有回文结构序列的DNA片段有些限制酶识别序列为8个或8个以上碱基对识别序列短，切点数多，产生的片段小；反之识别序列长，切点数少，产生的片段大切割位点：大多数酶是错位切割，产生粘性末端，少数酶产生平端或称钝端.,二 修饰酶,对DNA、RNA分子末端进行剪切、补平、连接、化学修饰的酶,1大肠杆菌DNA聚合酶I （全酶）,模板 DNA底物 dNTPMg 2+合成方向 53外切酶活性 53 35,Klenow fragment：,DNA
3、聚合酶I受枯草蛋白酶水解作用而产生（大片段 分子量76kD）53聚合酶活性35外切酶活性校正作用主要作用：补齐双链DNA的3末端标记探针在cDNA克隆中，合成第二链DNA序列分析,2 逆转录酶 reverse transcriptase：,常用的有两种：AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶模板：RNA底物：dNTP合成方向： 53（ 53RNaseH外切酶活性）主要作用：合成cDNA，建立cDNA文库,3 T4 DNA连接酶 T4 DNA ligase,主要作用连接双链DNA形成3，5-磷酸二酯键,4 末端脱氧核苷酰转移酶 TdT 俗称加尾酶,主要作用将脱氧核苷酸加到DNA的3-OH用于探针标记或
4、形成同聚尾的粘性末端便于连接,5 Taq DNA聚合酶,特点：可耐高温 53聚合酶活性 35外切酶活性主要用途：PCR DNA测序,6 碱性磷酸酶,来源有二：牛，细菌作用：去除5-磷,载体 vector,能够携带重组DNA进入宿主细胞，并在其中进行复制和表达的特殊DNA序列。载体通常分为克隆载体和表达载体理想的载体：具有自主复制能力；具有较多拷贝数；有足够的容量；单一特异的克隆位点；一个或多个筛选标记；有较高的遗传稳定性。,第二节 DNA重组载体,常用载体质粒噬菌体病毒,一 质粒 plasmid,基本特性：质粒是细菌细胞内的染色体外的共价闭合的环状DNA分子，能独立进行复制。可以赋予宿主细胞特
5、定的遗传性状.只有在宿主细胞内才能复制.,二 质粒的类型,接合型质粒、可移动型质粒和自传递型质粒严谨型质粒（stringent plasmid）、松弛型质粒(relaxed plasmid)窄宿主谱及广宿主谱质粒,DNA重组中所用质粒载体多用松弛型质粒改造而成。质粒载体的特点：具有松弛型复制子-增殖复制不可少的序列存在多个单一酶切位点-便于外源序列插入具有插入失活标记-便于筛选阳性克隆分子量较小-插入序列小于15kb,(一) pBR322：,双链环状，长4363bp拷贝数高（拷贝数：细菌中的分子个数）多个单一的限制酶位点两个抗药性基因标记：四环素抗性基因tetR 、氨苄青霉素抗性基因ampR
6、（外源基因插入失活）目前已被其它载体所取代,PBR322质粒载体,一个复制起始点（ori）二个抗性基因（Ampr,Terr）四个单一酶切位点（BamH,Hind,Sal,Pst,）分子量小，插入6kb序列高拷贝数，1000-3000,(二) pUC质粒载体系列,pUC18/19：由pBR质粒与M13噬菌体改建而成（二者方向相反）2.69kb复制起始点：来自pBR322氨苄青霉素抗性基因ampR 大肠杆菌半乳糖苷酶基因（Lac Z基因 ）启动子和肽序列多克隆位点,pUC质粒载体结构特点:,Ori-来自pBR322Ampr -无酶切位点LacZ序列-来自M13多克隆位点-来自M13可用蓝白斑筛选,
7、(三) 噬菌体载体 phage,本质为细菌的病毒 -能自用宿主细胞的蛋白质合成体系,进行生长和增殖.容量大，常用作基因组文库和cDNA文库克隆载体.双链噬菌体： 噬菌体单链噬菌体：M13、f1,(一)噬菌体,基因组：野生型含60多个基因，约48.5 kb，具有12bp的粘性末端。有溶菌和溶源性生长.其基因可分为必需基因和非必需基因.当后者被外源基因取代后,不影响噬菌体的生命功能.在病毒颗粒中为双链线型分子，进入大肠杆菌后立即环化。,噬菌体-插入型：,插入型：载体上只有一个限制酶位点，克隆时，在此点位切开，插入外源目的基因。常见的有gt10/11.适于6-8kb DNA片段的插入。主要用于cDN
8、A文库的构建。多用蓝白法筛选。,噬菌体-取代型：,取代型：也叫替换型。有两组反向排列的多克隆位点.基因组中约60%为溶菌所必须，中间40%为非必需，作其隆载体时可将这部分切除，插入目的基因。常见的有EMBL系列和Charon系列。插入长度可达30kb.用于DNA文库和cDNA文库的构建。,噬菌体作为克隆载体的优点：,感染能力强： 可以在体外包装，产生有感染性的噬菌颗粒，每个包装颗粒都有感染大肠杆菌的能力。有利于筛选阳性克隆： 只有一定长度（野生型的75%-105%）的噬菌体才能包装。 噬菌体经改造后，使非重组体噬菌体过小，无法包装和感染细菌。,噬菌体载体的插入失活,免疫功能失活型:合成阻遏蛋白
9、功能破坏,丧失溶原作用,生成清晰的噬菌斑.否则形成混浊噬菌斑.-半乳糖苷酶失活型:可用蓝白筛选法.,(二)粘粒载体,又称柯斯质粒:由质粒和噬菌体改造而成.具有噬菌体的特征:溶源生长,无法形成子代噬菌体颗粒.具有质粒载体特征:可复制,扩增.有抗性基因可供筛选用.,具有高容量克隆能力:可达45kb.具有同源序列重组能力应用:大片段钱外源序列插入-真核基因研究,(三) M13噬菌体,单链环状DNA，6.4kb.进入大肠杆菌后复制成双链容量小：1.5kb目前常用于单链外源DNA克隆。其它功能多被PCR技术取代。,三真核细胞的克性载体,(一) SV40 载体属于DNA病毒,基因组5.2kb双链分子.启动
10、子功能强,在宿主细胞可形成高拷贝.容量小:2.5kb现已不用,(二) 穿梭载体,穿梭载体是一类能在原核细胞中复制,又能在真核细胞中表达复制的载体.,构成-以PSVK3为例原核系统构件-复制子来自质粒,丝状菌体复制子;筛选标记 Ampr ; 启动子来自T7.真核系统构件-SV40复制起始信号;SV40早期启动子.RNA修饰信号-SV40小T抗原拼接信号;SV40早期区mRNA poly A 加尾信号.多克隆位点:在SV40启动子下游设计8个酶切位点.,三 表达载体 expressing vecter,用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体带有表达构件转录和翻译所需的DNA序列,（一）大
11、肠杆菌表达载体,与克隆载体相同的有：复制位点，抗性基因，克隆位点，可导入大肠杆菌内含有表达系统元件： 启动子核糖体结合部位克隆位点转录终止信号,1启动子 promoter,trp-lac启动子，又称tac启动子，为双启动子。由trp启动子加上lac操纵子中的操纵基因，SD顺序融合而成。tac启动子受lac阻抑物调控，异丙基硫半乳糖苷（IPTG）诱导表达。另有 噬菌体PL启动子受温度诱导表达。,2 核糖体结合位点 RBS,核糖体结合位点为大肠杆菌表达载体必不可少的元件，包括起始密码（ATG）和SD顺序。转录终止序列 几十bp ，长的可达700-800bp。,（二）哺乳动物表达载体,真核表达元件：
12、启动子/增强子-克隆位点-终止信号-加poly(A)信号。启动子：真核细胞启动/增强子，来源于病毒者效率较高。最为常用的加poly(A)信号来自SV40。,2基因克隆的基本过程,1 切:限制性内切酶分别消化目的基因和载体 2 连:DNA连接酶连接目的基因和载体3 导:将DNA重组体导入宿主细胞4 筛:筛选并扩增该克隆,基因工程的后处理,阳性克隆确定以后，还需进行表达量的检测和调整，往往需要反复数次。只有目的基因的表达产物达到一定量才具有生产价值。大规模的分离和纯化工作，常是最费时间和财力的重要环节。生产资格的获得亦不是轻而易举的事情。,（三）基因改造,基因定向突变（site-directed
13、mutagenesis)最常用的是利用PCR进行的基因定向突变。另一种利用M13噬菌体产生的单链DNA，现已不常用。,利用PCR技术进行基因定向突变的基本过程 （1）设计四条引物,进行第一次PCR,进行第二次PCR,一 基因的获取 克隆与改造,(一) 基因的获取方法:用PCR技术获取从基因组文库或cDNA文库中获取人工合成,(2)基因文库,包括基因组文库和cDNA文库,基因组文库,基因组文库是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体。基因组文库以DNA片段的形式贮存某一生物的全部基因组DNA（包括所有编码区和非编码区）信息。,基因组文库的构建,过程：提取细胞基因组适当限制性内切酶消化，以获得一定大小的DNA片段克隆到噬菌体载体中克隆数代表基因组DNA片段数的种类（106）克隆筛选：核酸杂交克隆扩增,基因组文库,常用载体噬菌体粘粒酵母人工染色体（YAC）,cDNA文库,概念：cDNA文库指包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体。cDNA文库以cDNA片段的形式贮存着该组织的基因表达信息。,cDNA文库,构建过程提取组织细胞中的mRNA反转录获得cDNA克隆(106)克隆筛选:核酸杂交最为常用克隆扩增,
