1、中国大陆不同地区光壳钉螺遗传多样性的RAPD 分析中国血吸虫病防治杂志 2003 年第 15 卷第文章编号】0056661(2003)040251044 期 ChinJSchistoControl2003,Vo1.15,No.4?251?中国大陆不同地区光壳钉螺遗传多样性的 RAPD 分析许静,郑江摘要目的用随机扩增多态性技术(RAPD)对中国大陆 5 省不同地区的光壳钉螺进行分析,研究光壳钉螺群间的遗传多样性.方法提取钉螺头足部的基因组 DNA,用随机引物进行扩增,扩增产物经 8 的聚丙烯酰胺凝胶电泳,0.6 硝酸银染色,判别结果进行分析.结果 9 个螺群的平均遗传相似性为 0.7214,平
2、均百分匹配数为 0.6809,聚类结果表明可分为 3 个分类群,云南大理和四川 I 普格的钉螺为第一分类群,福建福清和江苏东台的钉螺为第二分类群,安徽的 4 个螺群和江苏官兴的钉螺为第三分类群.结论在我国各地的光壳钉螺螺群问存在一定的亲缘关系的同时,已发生了较大的遗传变异,聚类结果中螺群的聚类地位和其地理分布基本上一致,但江苏东台光壳螺群的聚类地位有待进一步分析和研究.关键词 湖北钉螺 ;随机扩增多态性 DNA;基因组;DNA中图分类号R383.24文献标识码AGENETICDIVERSITYOFSMOOTHSHEILEDONCOMELANIAHUPENSISFROMMAINLANDOFCHI
3、NABYUSINGRANDOMAMPLIFIEDPOLYMORPHICDNATECHNIQUEX“png,Zhengjiang(InstituteforParasiticdisease,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevent/on,Shanghai200025,China)AbstractObjectiveToanalyzethegeneticdiversityofsnailpopulationsfromfiveprovincesinChinamainland.MethodsGenomicDNAWSamplifiedbyrandomprimerandt
4、heproductswereelPctrophoresedby8polyacrylamideandstainedby0.6silvernitrogen.TheresultswererPcordedandanalyzed.ResultsTheaveragesimilarityandmatchpercentageamongtheninesnailpopulationswere0.7214and0.6809respectively.Theclustertreesshowedthattheninesnailpopulationscouldbedividedintothreegroups:snailsf
5、romDaliofYunnanProvinceandPugeofSichuanProvincewerethefirstisolatedgroup;snailsfromFuqingofFujianProvinceandDongtaiofJiangsuProvincewereclusteredintothesecondgroup;theotherfourpopulationsfromAnhuiProvinceandsnailsfromYixingofJiangsuPlovincebelongtothelastgroup.ConclusionThereisalargediversityamongsm
6、oothshelledsnailsinChinaalthoughcloserelationshipexists.Theclustertreesgainedbydifferentsnailpopulationsarebasicallythesameandconsistentwiththedistributionofthesepopulations.However,furtherstudyshouldbecarriedoutontheclusterofsmoothshelledsnailsfromDongtaiofJiangsuProvince.-KeywordsOncomelaniahupens
7、is;RAP);genome;DNA作为日本血吸虫的唯一中间宿主,湖北钉螺(Oncomelaniahupensis)尤其是光壳钉螺在中国有广泛的分布,除云南,四川 I 山区外,长江中下游地区以及福建省亦有分布.周晓农等对我国大陆 34 个现场钉螺的研究表明钉螺种群内差异较小,种群间变基金项目作者单位作者简介国家“ 十五攻关“ 项目(2001BA705B08)中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,WHO疟疾,血吸虫病和丝虫病合作中心(卜海 200025)许静(1978 一), 女,硕士.实习研究员.研究方向:分 l流行病学?论着?异为中等程度,且光壳钉螺较肋壳钉螺的分布更散在,遗传变异和分化也
8、远大于肋壳钉螺.RAPD(randoraamplifiedpolymorphicDNA,随机扩增多态性DNA)技术作为一种在基因组水平的研究方法.,具有快速简便的优点,可以反映物种,种株之间的遗传变异.本研究选取我国大陆几个代表性地区的光壳钉螺,应用 RAPD 技术进行分析 ,以期通过遗传相似性定量分析光壳钉螺螺群间的遗传关系.许静等:中国大陆不同地区光壳钉螺遗传多样性的 RAPD 分析材料和方法1 材料1.1 钉螺钉螺于 2001 年 4 月底至 5 月初,分别采集于云南,四川,福建,江苏,安徽 5 省 8 个地区,其中云南大理和四川普格代表西南大山区的流行区,福建福清代表东南沿海丘陵地区,
9、江苏和安徽代表长江中下游的丘陵地区,另外,江苏东台为沿海地区.将各地采集的钉螺分别编号:云南大理(YD),四川普格(SP),福建福清(FF),江苏东台(JD),江苏宜兴(JY),安徽宁国(AN), 安徽宣州(AX1,AX2),安徽青阳(AQ).其中 AX2 和 AQ 为肋壳钉螺,其余均为光壳钉螺.1.2 主要试剂 Tris,EDTA,Sarkosyl,蛋白酶K,CTAB,Chloroform,AmmoniumPersulfate,TEMED,BisAcrylamide,Acrylamide,Taq 酶,dNTP,硝酸银.1.3随机引物上海生物工程公司合成,引物 G十 C 含量在 509/670
10、.S01CAGGCCCTTCS02TGCGGGTCCTS03CTGATGCTACS04AGTGCTACGTS05CTGCTGGGACSo5AGGGAACGAGSo7GTGAGGCGTCS08GTTGCCGAGCSo9GAGCCCTCCAS10TCACGTCCACS11CTGACGTCACS12AGCGTCCTCCS13GTCTACGGCAS14AGGGCCGTCTS15CATGCAGGCGS16GGTCCCTGACS17CCCGTAGCAGS18ACAGCCTGCT2 方法2.1 钉螺基因组 DNA 的提取雌性钉螺个体头足部的肌肉匀浆后,参照 SpolskyCM 等4(1996)的方法(稍有修
11、改) 提取基因组 DNA,19/6 琼脂糖凝胶电泳 EB 染色以及 DNA 蛋白质分析仪检测基因组DNA 的纯度和含量.2.2RAPD 反应反应总体积为 501:包括 311 超纯水,5110buffer,2.25mmolMg 抖,dNTP 各 0.1mmol,1.8pmol/LPrimer,2.5uTaq酶,模板 DNA30ng,并覆盖一层石蜡油.PCR 反应循环参数为:94变性 1min,37C 退火 1min,72C延伸 2min.共 45 个循环,最后一个循环 72延伸 5rain,存于 4C.扩增结果用 89/6 的聚丙烯酰胺进行垂直电泳,25V 预电泳 0.5h,50V 电泳 2.
12、5h.0.6 硝酸银染色 0.5h,BioRad 凝胶成像系统拍照.2.3 数据分析判读每一个个体的扩增结果,有条带记为 1,无条带记为 0,将全部结果编成文件.以Phylip 文件的格式输入 Phyligeneticcomputertools进行下列公式的计算:相似性系数:S 一 2NxY/(Nx+NY+2N)百分匹配值6:M 一(NAH+NxY)/(NAB+NxY+Nx+Nv)其中 Nxv 为两个体共同享有的条带数,NAB 为个体 1 和个体 2 共无的条带数,Nx 为个体 1 有而个体2 无的条带数,Nv 为个体 2 有而个体 1 无的条带数 .将遗传距离 D(1-S)和参数 D(1 一
13、 M)矩阵输入phylip 软件包,NEIGHBoR 程序的 UPGMA 方法,FITCH 程序分别对矩阵进行聚类分析,TREEVIEw 软件绘制进化树 .结果鉴于光壳钉螺螺群内相对的遗传稳定性,本研究设计了 2 条引物筛选的原则:不同螺群间表现出遗传多态性;多态性在同一螺群的同一个体和不同个体间是稳定可重复的.每条引物除对各地钉螺的群体基因组 DNA 进行扩增,还对螺群内进行个体内和 4 个不同个体间的基因组 DNA 进行扩增,结果只有 S15,S182 条引物符合引物的筛选原则 .随机选取各个螺群内的 13 个个体进行分析,结果除福建的 1 个个体在 S15 的扩增结果中比其他个体缺少 1
14、5Obp 这 1 条带外(可能是由于个体变异引起的),其余均有很好的重复性(图 1,2).sslss2ss3ss4Mss5ss6ss7图 1S15 对四川 7 个个体基因组的扩增结果Fig.1Amplificationof7snailsofSichuanProvincebyPrimerS15sslss2ss3ss4Mss5ss6ss7量_.l 童曼 Ill-2000bp一100bp一80bp图 2S18 对四川 7 个个体基因组的扩增结果Fig.2Amplificationof7snailsofSichuanProvincebyPrimerS18一一二一一I】 】-曼一一中国血吸虫病防治杂志
15、2003 年第 15 卷第 4 期ChinJSchistoControl2003,Vo1.15,No.4?253?s15,S18 对 9 地钉螺个体共产生 82 个条带,其中 16 个条带为所有钉螺共有,条带共享率为19.51.安徽 4 地的钉螺共产生 56 个条带,条带共享率为 67.86,江苏 2 地的钉螺共产生 61 个条带,共享率为 57.37%.引物对 9 地钉螺的扩增条带在 1328 之间不等,地理位置越近的钉螺其共有条带和共无条带越多.根据所有钉螺个体间出现的RAPD 扩增条带 ,计算出螺群间遗传相似性和百分匹配数(表 1).由表看出:螺群间的遗传相似性为0.58820.9263
16、,平均值为 0.7214,螺群间百分匹配值为 0.54880.9146,平均值为 0.6809.同一省内的相似性系数和百分匹配值较高,而省间螺群问的值较小.表 1 螺群间遗传相似性系数和百分匹配数矩阵Table1Matrixofsimilarityandmatchpercentage注:对角线以上为相似性系数 S,以下为 M.tipperthediagonallineisSandbelowM.用 Phylip 软件的 NEIGHBOR 程序的 UPGMA 结构稍有变异外,聚类结果基本上一致.9 个螺群被方法,FITCH 程序对遗传距离 D(1 一 s)和参数 D(1 一分为 3 类,云南大理和
17、四川普格的螺群为第一分类M)矩阵进行聚类分析,TREEVIEW 程序作进化树群,福建福清和江苏东台的螺群为第二分类群,安徽(见图 36), 可以看出所得的 4 个聚类图谱除拓扑的 4 个螺群和江苏宜兴的螺群为第三分类群.图 3FITCH 对 Neis 遗传距离 D(1 一 s)的分析Fig.3AnalysisofNeiSdistancebyFITCHprogram图 4UPGMA 对 NeiS 遗传距离 D(1 一 S)的分析Fig.4AnalysisofNeiSdistancebyUPGMAprogram图 5FITCH 对 D(卜 M)的分析Fig.5AnalysisofDbyFITCHp
18、rogram图 6UPGMA 对 D(卜 M)的分析Fig.6AnalysisofDbyUPGMAprogram许静等:中国大陆不同地区光壳钉螺遗传多样性的 RAPD 分析讨论随机扩增多态性 DNA 技术中的所谓随机引物,一是指引物核苷酸序列的随机性二二是指引物与模板相应序列的随机结合.因此每个引物都具有检测种,株间不同的多态性的潜能,但并非所有引物均能扩增出有意义的带型,也并非均可适用于任何物种,因此可根据实验目的筛选有意义的引物,此为RAPD 技术的关键 .鉴于光壳钉螺相对的遗传稳定性,本研究根据 2 个原则对 18 条随机引物进行了筛选,引物$15,S18 可在螺群间表现出遗传多态性而在
19、群内个体内和个体问产生稳定可重复的扩增结果.一般理想的分子分类标记应具备以下几点:高度的多态性,操作简单易行,可提供高的信息量,确切可靠 j.对于前 3 条,作为一种理想的分子分类方法,RAPD 技术已经具备对于第 4 条,RAPD 则存在一定的缺陷.通过一系列的重复实验,本研究确立了最优扩增体系,可产生稳定可重复的扩增结果.在 S15,S18 对 9 个采集点的各 13 个钉螺个体基因组进行扩增时,分别作阳性和阴性对照,结果表明各采集点内的个体问除染色深浅稍有差异外,带型基本上一致.每个个体的扩增结果均可看成该采集点内同一引物扩增的标记图谱.另外,相似性系数(s)的分析实际上考虑的是显性位点
20、的共性,而忽略了条带共无的共性,为此,本研究同时用百分匹配数来分析共无条带和共有条带.当然,某一标记的共无并不意味着两者绝对是相同的隐性基因,也可能是两个不同的基因,但亲缘关系越近,存在这样问题的严重性越小.比较 UPGMA 和 FITCH 对两个距离矩阵的聚类分析,除个别分支的拓扑结构不稳定外,聚类地位结果是基本一致的.根据 Neis 距离的聚类结果,云南大理和四川普格的钉螺首先从聚类结果中分出来,两者间的遗传距离为 0.242105,与以往 Davis等将云南和四川的钉螺归为滇川亚种的结果一致;安徽的 4 个螺群与江苏宜兴的螺群组成第二簇,其Neis 遗传距离 (O.08000.2121)
21、在 Davis(1995)同工酶方法中湖北钉螺指名亚种内的遗传距离范围内 j,这与 ThomasWilke 通过对长江中下游几个地区螺群的 COI 基因测序分析,认为长江中下游地区的光壳钉螺和肋壳钉螺问的 Neis 遗传距离没有显着性的差异,因而可能同为湖北钉螺指名亚种的结果一致_9j.结果表明长江下游地区的肋壳钉螺和光壳钉螺在遗传上有很大的遗传同源性,可能是由于长期在不同的环境影响下或为适应环境而发生形态学上的变化.江苏东台和福建福清的钉螺为第 3 组,两者地理位置较远,但均采集白海滨地区,是由于适应相似的生态环境长期同向进化的结果还是由于基因漂移的原因有待于进一步分析.在今后的研究中可通过
22、筛选更多的随机引物和选择更多地区的钉螺作进一步的分析,从而为钉螺的易感性和钉螺扩散及血吸虫病流行病学提供更多的信息.(本研究得到江苏省寄生虫病防治研究所高琪研究员以及该所领导和有关同志的大力支特及帮助,同时本所周晓农,陈名刚研究员给予了热心的帮助,谨此致谢!)参考文献1周晓农,孙乐平 ,洪青标,等.中国大陆钉螺种群遗传学研究 1 种群遗传变异J中国血吸虫病防治杂忐,1995,7(2):6771.2WilliamJG,KubelikAR,IivakK1,eta1.DNApolymorphismsamplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmarker
23、s 口.NuccAcidsRes,1990.18(22).653165353WelshJ,McCkellandMwitharbitraryprimersJ7218.Fingcrf】rintnggenomeusingPCRMolEcol,1990,l8(24):72l3 一4SpolskyCM,DavisGM,ZhangY.Sequencingmethodologyandphylogeneticanalysis:cytochromebgenesequencerevealssignificantdiversityinChinesepopulationsofOncomelania(Gastropod
24、a:Pomatiopsidae)J.Malacologia,1996,38(12):213221.5NeiM.MathematicalmodelforstudyinggeneticvariationintermsofrestrictionendonucleasesJ.ProcNatlAcadSci,1979,76:52695273.63BlackIvWC,DuteauNM,PuterkaCJ,eta1.UseoftherandomamplifiedpolymorphicDNApolymerasechainreaction(RAPDPCR)todetectDNApolymorphismsinaphids(Ho
