1、实验四 生物标志物实验水生动物谷胱甘肽转移酶活性测定,指导老师：刘汝涛山东大学环境科学与工程学院,目录,目的与要求,实验原理,设备与材料,3,2,步骤与方法,结果与报告,5,4,1,Company Logo,（1）了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活 性影响。（2）掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法。,Company Logo,谷胱甘肽转移酶（GSTs；也叫谷胱甘肽转硫酶）是细胞质内催化相反应起解毒作用的重要酶，具有许多同工酶。污染物进入体内经过相反应后，在谷胱甘肽转移酶的催化下，细胞内还原性谷胱甘肽能结合相反应产生的亲电性中间体，从而生成亲水性的化合物。细胞膜上有多种的跨膜运输机制
2、（如通过ATP推动GS-X泵）能使这类亲水性的化合物排出细胞，使之进入血液循环并最终以尿液等形式排出体外，从而起到解毒作用。在很多物种中，谷胱甘肽结合作用是相反应的主要形式。 GSTs催化的一般反应为： GSH +R-X = GSR + HX 在该反应中，GSTs的主要功能是通过其活性中心增加GSH和亲电性底物的接触机会，然后激活GSH上琉基，诱导其对底物的发动亲核性攻击从而形成结合产物。,Company Logo,迄今的研究表明GSTs存在于所有的动物体内，肝脏是脊椎动物种GSTs分布的主要场所。鼠肝中的GSTs占可溶性肝蛋白的10，而鱼肝中的GSTs也是可溶性肝蛋白的主要成分。GSTs能被
3、多种的污染物所诱导，如有机氯农药、多环芳烃和多氯联苯等。在哺乳动物中，经多环芳烃处理后，其肝脏中GSTs活性比对照组高1.52.0倍。在不同的水生动物体内GSTs可被多环芳烃诱导，其活性高于对照组2倍。野外研究发现，在同一条河流中，污染段面鱼体内肝脏组织和消化管组织中GSTs含量和活性比清洁断面高出34倍。然而，研究也发现GSTs活性活性诱导受环境条件、生物种类和化合物性质的影响，存在较大的差异。 基于上述原因，用GSTs作为生物标志物来指示特定的污染暴露，近年来在生态毒理学的研究中获得了广泛的运用。在本实验中，将采用体内实验的方法，测定水生动物暴露于有机氯农药林丹（Lindane）之后，其体
4、内GSTs酶活性的变化。,Company Logo,1器材 冷冻离心机（Beckman Coulter 22R centrifuge），酶标仪（Bio-Tek Instruments，INC）pH计，溶解氧测定仪，电导率测定仪，96孔板，1.5mL离心管，水浴锅，生物冰袋，移液枪（20uL、100uL、1000uL）及对应枪头。 2受试生物 成年雄性的钩虾（Gammarus pulex）。从野外采集投放在 10L的有机玻璃缸中，人工曝气，在 15（1），12h光照的条件下至少驯养一周，才能进行染毒暴露。驯养期间，用接种了真菌（Cladospurium sp.）发酵1周的桤木叶（Alnus gl
5、utinosa L.）喂食。,Company Logo,3试剂 1-氯-2，4-二硝基苯（CDNP），还原性谷胱甘肽（GSH），谷胱甘肽转移酶标准品（GSTs），苯甲基磺酰氟（PMSF），Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），EDTA。 4溶液的配制 （1）林丹储存液 取50mg林丹固体颗粒，溶于500mL的丙酮中配制成100mg/L的林丹储存液，于4下阴暗处密封保存备用。,Company Logo,（2）酶和缓冲液 配置pH=6.5，0.02M磷酸缓冲液（PB） 利用此磷酸缓冲液配制下面三种实验缓冲液： （i）组织破碎缓冲液（HB）：含有1.0Triton X-100（v/v）和1
6、.0PMSF（v/v）的磷酸缓冲液； （ii）冲洗缓冲液（DB）：含有1.0PMSF（v/v）的磷酸缓冲液； （iii）空白缓冲液（BB）：含有0.1Triton X-100（v/v）和1.0PMSF（v/v）的磷酸缓冲液。 100mmol/L PMSF溶液 用95乙醇溶解适量的PMSF，于阴暗处保存，-20可保存一个月，-4可保存5d。,Company Logo,40mmol/L CDNB溶液 用95乙醇溶解适量的CDNB，保存方法与PMSF相同。 20mmol/L GSH标准液的配制 配制100mmol/L EDTA母液，用0.1mol/L KH2PO4稀释母液至EDTA的浓度为1mmol
7、/L。在1mmol/L的EDTA溶液中加人适量GSH使其终浓度为20mmol/L。用1mol/L HCl或1mol/L KOH校正pH。于阴暗处保存，-20可保存一个月，-4可保存5d。 酶活测定液 实验之前配制，将CDNB和GSH溶液从冰箱中取出，置于室温。取5份的20mmol/L GSH标准液、9份的磷酸缓冲液（pH=6.5，0.02mol/L）和1份的40 mmol/L CDNB溶液，充分混合，配制成酶活测定液。,Company Logo,1暴露试验 按照急性毒性试验方法，将雄性的成年钩虾分别暴露于梯度林丹浓度中。暴露温度设定在151，光暗比为12h12h。实验开始时测定各浓度梯度林丹曝
8、气水的溶解氧，pH和电导率。 暴露48h后，将存活的个体从容器中打捞出来，先用吸水纸将表面的水分吸干之后，然后放入1.5mL的聚乙烯离心管中（每管一只）。将这些离心管的放入液氮罐20s以猝死钩虾。取出的离心管在-70保存。,Company Logo,2酶活力的测定 将1.5 mL离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL的冷的组织破碎缓冲液（pH=6.5）。捣碎研磨管内的钩虾2030min，加入9uL冷的冲洗缓冲液DB（pH=6.5）。4下14000g离心3min，取100uL的上清。将此上清移另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加入900uL空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待
9、用。 在一个干净的1.5mL的离心管内加入500uL酶活为 1.4单位/mL的谷胱甘肽转移酶标准样品，加入500uL的冷的空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀。,Company Logo,在96孔板中加入50uL的GST标准样品，钩虾组织液上清或者空白缓冲液（BB），每组设四个平行。然后加入150uL酶活测定液，使每个孔内含有200uL的反应液。将96孔板放入酶表仪30轻微震荡反应30min，然后充分震荡96孔板以混合各反应液。340nm下每隔1min记录一个吸光值，计算吸光值随时间的变化的斜率。 式中：OD为吸光值随时间变化的斜率（OD340/min）；为摩尔吸光系数（9600mol-1
10、cm-1）；R为反应系统体积（uL）；S为样品上清的体积（uL）；W为样品蛋白浓度（g/L）； P为样品厚度（0.6cm）。,GST酶活,Company Logo,3总蛋白的测定 以牛血清蛋白为校正标准，用Bio-Rad公司的试剂盒检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋白溶于磷酸缓冲液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白标准液。取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL该蛋白标准液，先加入8mL磷酸缓冲液（pH=6.5），再加入空白缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓度依次为0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋
11、白标准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出800uL至干净的EP管中，加入200uL Bio-Rad产品。稀释缓冲液取80uL的虾组织液上清至一个干净的EP管中，加入80uL的 0.1的Triton X-100，用640uL磷酸缓冲液（pH=6.5）稀释混合液至800uL，加人200uL Bio-Rad产品。,Company Logo,从上述的反应体系中取出200uL和Bio-Rad反应过的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组设三个平行，加入96孔板内。25下，摇动96孔板20s后，用酶标仪测定620nm下的吸光度。根据牛血清蛋白标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率K。 式中：OD620为待测样品620nm下的吸光度；K为牛血清蛋白标准样曲线的斜率。,蛋白浓度,Company Logo,1.急性毒性试验结果记录,Company Logo,2酶活力与蛋白活力的测定试验结果记录,Company Logo,谢谢！,Company Logo,谢谢观看/欢迎下载,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH,
