1、朱泽亮：浅谈单克隆抗体药物的研究进展及开发现状1浅谈单克隆抗体药物的研究进展及开发现状09生化制药技术 朱泽亮 0911020147摘要： 抗体是体内最奇妙的分子，有巨大的多样性，任何被人体免疫系统视为“异己”的外源性物质，如细菌、病毒或毒素等，都能引起机体产生抗体，从而发挥预防和治疗疾病的作用，近年来单克隆抗体技术的出现是免疫学领域的重大突破。利用单克隆抗体靶向病变组织或细胞上表面抗原，已成为理想的靶向治疗方法，随着许多特效单克隆抗体药物的研制成功，单克隆抗体介导的靶向疗法将来一定会给防病治病带来新的希望。关键词：单克隆抗体药物 ；肿瘤；感染疾病Discussion on the resea
2、rch progress of monoclonal antibody drugs and their applicationAbstract A great diversity of antibody is the most wonderful molecular,any human immune system as “alien“ by exogenous substances,such as bacteria, viruses and toxins,it can cause the body to produce antibodies,in order to play the role
3、of prevention and treatment of disease,in recent years the monoclonal antibody technology is a major breakthrough in the field of immunology.the use of monoclonal antibodies targeting diseased tissue or cell surface antigen, it have become the ideal target treatment method,along with many specific m
4、onoclonal antibody drug development is successful,monoclonal antibody mediated targeting of therapy will in the future to prevent and cure diseases brings new hope.Key word Monoclonal antibody drugs ；Cancer； Infection江苏农林职业技术学院毕业论文2目 录1.引言 .32.单克隆抗体技术历史与发展简述 .33.单克隆抗体药物的研究进展 .33.1 单克隆抗体药物的分类 .33.2 作
5、为肿瘤治疗药剂的单克隆抗体药物 .43.3 抗肿瘤单抗偶联物 .44.单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 .44.1 单克隆抗体制备的原理 .44.2 单克隆抗体制备的方法 .44.2.1 抗原制备 .44.2.2 免疫动物 .54.2.3 免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备 .54.2.3.1 脾细胞制备 .54.2.3.2 骨髓瘤细胞制备 .54.2.4 细胞融合 .64.2.5 杂交瘤细胞的大量繁殖 .64.3 单克隆抗体的提纯 .64.4 单克隆抗体的鉴定 .75 单克隆抗体的应用 .76 单克隆抗体治疗药物发展现状及展望 .86.1 单克隆抗体治疗药物发展现状现状 .86.2 单克隆抗体治疗药物
6、的展望 .87 结束语 .8参考文献 .9致谢 .10朱泽亮：浅谈单克隆抗体药物的研究进展及开发现状31.引言单克隆抗体技术(简称单抗) , 又被称为肿瘤“ 生物导弹” ,是能直接导向肿瘤的药物。1975 年英国科学家Kohler和Milstein将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合, 成功的建立了单克隆抗体技术, 因此在1984 年获得诺贝尔医学和生理学奖。几年来, 这项技术发展十分迅速, 对生物医学的许多领域发生了很大影响, 给人们增加了新知识, 新概念。单克隆抗体的应用, 给许多疑难性疾病的诊断、治疗和预防带来了新的希望。2.克隆抗体技术历史与发展简述 1975年Kohler和Milste
7、in 在英国剑桥大学分子生物学实验室首先制备成功绵羊红细胞的单克隆抗体,建立了用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体的方法。随着现代生物技术的飞速发展， 以及对抗体分子结构和基因结构的深入了解，抗体药物的发展进入了基段，单克隆抗体(简称单抗)作为治疗性药物真正成为可能。1980年代后期，随着通过保留小鼠抗体的可变区序列、并以人抗体的恒定区序列取代小鼠抗体的恒定区序列构建成的人一鼠嵌合抗体的出现大大减少了鼠源序列在抗体分子中的比例，降低人体发生抗抗体反应的风险。1986年抗体人源化技术的发明，又使鼠源序列的比例进一步降低。1990年代早期，噬菌体展示技术和转基因小鼠技术提供了制备全人抗体的可行性。第
8、一个嵌合抗体阿昔单抗 因可抑制纤维蛋白原与血小板的结合，于1994年被批准上市，用于治疗血栓形成。而第一个人源化抗体达利珠单抗和第一个全人抗体药物阿达木则分别于1997年和2001年上市，用于治疗急性肾移植排斥反应和风湿性关节炎。近年来，各种基因工程抗体的成功制备和应用，以及抗体生产水平的显著提高将抗体药物的研发带人了一个快速发展的新阶段 目前已有28种治疗性抗体制品应用于临床，主要用于肿瘤、自身免疫性疾病、慢性炎症反应、器官移植排斥及病毒感染的治疗。治疗性抗体已成为目前制药行业增长最快、盈利最大的产品之一， 其全球的销售总额从2002年的50亿美元增长为2008年的300亿美元，预计到201
9、4年将超过580亿美元，届时全球销售量最大的前10种药物，抗体类产品可能将占到5种。3.单克隆抗体药物的研究进展3.1 单克隆抗体药物的分类单抗药物一般分为：治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如：最早被美国FDA批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗；抗肿瘤单抗偶联物，或称免疫偶联物，由单抗与有治疗作用的物质(如：放射性核素、毒素和药物等)两部分构成，其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物，此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等。3.2 作为肿瘤治疗药剂的单克隆抗体药物(1)利妥
10、昔单抗江苏农林职业技术学院毕业论文4(2)曲妥珠单抗(3)阿伦珠单抗(4)西妥昔单抗(5)贝伐单抗3.3 抗肿瘤单抗偶联物(1)放射免疫偶联物(2)免疫毒素(3)化学免疫偶联物4.单克隆抗体的制备、纯化及鉴定单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。4.1单克隆抗体制备的原理骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的 B 淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞
11、能无限制增殖的特性，又具有免疫 B 细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在 HAT 培养基含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成 DNA 的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成 DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在 HAT 培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体
12、。4.2单克隆抗体制备的方法4.2.1抗原制备一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。A可溶性抗原（蛋白质） 以 1mg/ml5mgml 的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为 0.3ml0.6ml，间隔 35 周再同样注射一次，10 天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原 0.2ml0.4ml，34 天后，杀死小鼠取脾做融合用。B. 颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以 1浓度每只皮下注射 0.2ml，每周 2次，共免疫 58 次，取
13、脾前 3 天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。4.2.2 免疫动物朱泽亮：浅谈单克隆抗体药物的研究进展及开发现状5目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从小白鼠系诱导出来。小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以 812 周龄为宜。大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠大鼠，小鼠人以及人人杂交瘤技术。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的 B 淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生 1.01075
14、.0107 种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的 B 淋巴细胞大量增加。B 淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的 B 淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后 78 天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。4.2.3 免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备4.2.3.1 脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c 鼠，拉颈或用 CO2 处死小白鼠。(
15、2) 将小鼠放于 70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3) 把脾放入 5ml 含有 2.5FCS 的 1640 液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。(5) 直立小试管 3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。(6) 以 2.5FCS1640 充满离心管，并以 400g 离心 7min10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。(7) 把沉淀用约 10ml 的新鲜培养液再悬浮。(8) 重复、 步骤。(9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于 80为合格。4.2.3.2 骨髓瘤
16、细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产江苏农林职业技术学院毕业论文6生 球蛋白或不分泌到细胞外；骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好 106 个细胞/ml；生长速度快，繁殖时间短。4.2.4 细胞融合小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的 B 淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓
17、瘤细胞与分泌霜种抗体的 B 淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有 B 淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在 HAT 选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某 B 淋巴细胞产物单克隆抗体。4.2.5 杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来
18、的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的 1001 000 倍。利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。4.3 单克隆抗体的提纯(1)小鼠腹水用冷 PBS 液稀释 4 倍后，于 1.00105 转离心 30min，去沉淀。(2)在 4于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为 50硫酸铵浓度。(3)此溶液置冰中 30min60min，然后 5 00
19、0r/min 离心 10min，去上清。(4)将沉淀溶于 TrisHCl 缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。(5)装入透析袋于 TrisHCl 缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。(6)离心去沉淀。(7)溶液稀释（1:100 或更高倍稀释）后，于 280nm 测蛋白含量，估计蛋白质含量 1A 280unit=0.8mg 蛋白质一般每 ml 腹水中，含有总蛋白约 25mg36mg。(8)过 DEAE纤维素柱：纤维素柱高 40cm，以 20mMol/L NaCl Tris 缓冲液平衡。透析样品以 Tris 缓冲液等量稀释。朱泽亮：浅谈单克隆抗体药物的研究进展及开
20、发现状7样品进入柱床速度为 1ml2ml/min，以 NaCl 线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG 于 40 mMol/L 和 80mMol/L NaCl 洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于 120 mMol/L 150 mMol/L NaCl 洗脱。测 OD280nm 收集蛋白峰，单克隆 IgG 保存备用。杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是 IgG 和 IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且 3 天后就取脾，多为产生 IgM 的 B 淋巴细胞。免疫多次的多为 IgG。4.4 单克隆抗体的鉴定4.4.1 杂交瘤细胞染色体的检查 采用秋水仙素裂解法进行。4.4.2 单克隆抗体的
21、类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠 Ig 类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或 ELISA 夹心法测定单抗的 Ig 类型和亚型。4.4.3 单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA 法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。4.4.4 单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA 或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达 5104。而采用 ELISA 检查，腹水效价可达 1.0106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。4.4.5 必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。单克隆抗体技术
22、：克隆化经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要 35 次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软
23、琼脂平板法及荧光激活分离法等。5.单克隆抗体的应用单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。5.1检验医学诊断试剂作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。目前，应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的的检测；江苏农林职业技术学院毕
24、业论文8激素测定；细胞因子的测定。单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。5.2 蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如 Speharose 2B、4B 、6B 等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或 pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。5.3 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术将针对某
25、一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。6.单克隆抗体治疗药物发展现状及展望6.1 单克隆抗体治疗药物发展现状现状与其他治疗方法如小分子药物相比，抗体药物由于其对靶点高度特异而有效的识别及独特的作用机制，具有以下几方面优势：通常能被机体耐受，安全性高，对人体的非特异性毒性低；抗体作用靶点通常为细胞外蛋白，不易发生突变，发生耐药的可能性较低；抗体在体内的半衰期通常为13周，使长间隙(每周甚至34周一次)给药成为可能
26、。并且抗体药物可诱导ADCC和CDC等免疫效应机制，能提供多种杀伤靶细胞的途径。随着越来越多的抗体药物用于人体治疗。近年来其自身的安全性也逐渐成为人们关注的问题之一。甚至有些抗体产品已先后退出市场。因此，开发抗体药物还有多个环节需要改善，目前主要集中在提高疗效、增强安全性、扩大应用范围、提高生产水平、降低成本等方面。近年来采用药物基因组学的方法，在对抗体药物改造的同时，通过对“生物标记(biomarker)”的检测，选择最有可能对某抗体产生疗效的病人进行治疗。例如，美罗华对CD20抗原阳性的血液肿瘤患者具有较为显著的疗效。同样两妥昔在ras基因野生型的肿瘤中有显著疗效，而在发生ras基因突变的
27、肿瘤中几乎没有疗效。应用这种生物标记的方法，不仅有利于加速药物的研发进程、提高成功率，而且也使个体化用药成为可能。6.2 单克隆抗体治疗药物的展望单抗药物治疗主要是利用其靶向性，来干预肿瘤发生发展过程中的各个通路，或是激活宿主对肿瘤的免疫等。随着生物医学的不断发展，一定会出现具有更高靶向性的单抗和药效更强的“弹头”。近年美国FDA连续批准5个单克隆抗体药物上市，这无疑是f临床医学、制药领域中的巨大突破。但是，单抗药物朱泽亮：浅谈单克隆抗体药物的研究进展及开发现状9还存在一些尚未解决的问题，最突出的问题是如何降低单抗的免疫原性，单抗的异源性所引起的抗体反应，不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来
28、严重的后果。因此，对异源性单抗进行改造以及人源性单抗的研制成为单抗研究的重要方向。7.结束语回顾抗体药物的发展历程，一方面进一步坚定了我们的信心，抗体药物虽然还存在这样那样的问题，但其理论性已经得到充分证实，市场潜力巨大；另一方面，我们也应该清醒地意识到，在新一轮的抗体药物浪潮中留给我们的机会和切入点并不多，盲目跟从有可能重现 20 世纪 90 年代我国生物技术药物开发的情景，不但不能实现振兴我国生物技术药物的梦想，反而使我国抗体药物的研发陷入被动局面。江苏农林职业技术学院毕业论文10参考文献1朱学泰，谢溱，马瑞君.单克隆抗体制备技术研究进展 J，甘肃科技，20052崔运昌.解放军医学杂志 M
29、,1982 3朱桢平.科学 J.上海科技出版社, 2011.14张松，於席芳肿瘤用药大全 J湖北人民出版社，20055张 洁利妥昔单抗在血液系统临床应用研究新进展 M中国新药杂志6彭涛，王林炎症和免疫系统疾病 J国外医学药学分册，20057胡大强抗肿瘤血管生成的靶点研究概况 J中国药业，20058黄世杰雷尼珠单抗照亮了湿性老年黄斑变性病人的未来 J国外医学药学分册9张军.依法利株单抗 M.中国新药杂志，200610周文斌，刘萍.达利珠单抗在人心脏移植中的前景 J国外医学药学分册，2005致谢首先，我要特别感谢黄小忠老师对我的悉心指导，在设计期间黄老师帮我理清设计思路，提出有效的改进方案。导师渊博的知识、严谨的学风、诲人不倦的态度和学术上精益求精的精神使我受益终生。感谢生物工程系 09 生化制药班的各位老师对我的培养和
