1、论文开题报告书：桉树转基因检测方法的研究论文开题报告书：桉树转基因检测方法的研究发表时间:2013-5-14 18:00:56大学本科毕业论文(设计)开题报告学院：化工学院 专业班级：08 生物工程一班 课题名称桉树转基因检测方法的研究1、本课题的的研究目的和意义：目的：通过正交试验，找出桉树愈伤组织分化产生芽的最优培养基；筛选出最适合农杆菌侵染桉树愈伤组织的条件（如侵染时间、暗培养时间、头孢浓度等） ；通过对多种目的基因检测方法的试验，确定目的基因是否成功导入，并确定最准确、方便、快捷的检测方法。意义：通过一系列的试验，确定最优直分培养基，提高发芽率，以便进行重复性试验或大规模培养；同时，出
2、芽率的提高有利于目的基因的成功导入，为抗寒、高木质素基因的导入提供更好的条件，增加 成功率；转基因检测技术的优化可以更加准确的确定目的基因是否成功导入受体细胞，增加试验的准确性。综述: 桉树在我国的应用广泛，在生态统一直未能较好建立。本试验桉树叶和茎为对象, 建立了百合基因转化直接分化受体系统, 为基因转化获得抗逆性强的桉树奠定了基础。3、本课题的主要研究内容（提纲）和成果形式：1.转基因体系的优化2.转基因桉树的检测3.用酚-氯仿法提取 DNA、PCR 检测4、拟解决的关键问题：（1） 、优化出最优的桉树芽直分培养基。（2） 、选择优化出最准确、快捷的转基因桉树苗检测技术。（3） 、确定最优
3、的基因导入条件。5、研究思路、方法和步骤一转基因体系的优化1.1 直分培养基优化方案一：KT、NAA、蔗糖浓度、及琼脂添加量对桉树的茎和叶的直接分化影响（根据因素水平选择四因素三水平正交表，实验重复两次）1.2 直分培养基优化方案二：6-BA、IAA、Cys 添加量对桉树的茎和叶的直接分化影响（根据因素水平选择 5 因素 4 水平正交表）1.3 不同 Kem 浓度对桉树外植体再生能力的影响。1.4 不同 Cef 浓度对桉树外植体再生能力的影响。1.5 侵染法和超声法对导入桉树组织目的基因成功率的影二转基因桉树的检2.1 转基因植物 PCR 检测.提取 DNA 方法（CTBA 法）： 1） 称取
4、 1g 新鲜桉树叶片片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，将叶片研至粉末。2） 将叶片粉末转入一个 30mL 离心管中。3）.加 10mL CTBA 抽提缓冲液，轻轻转动离心管使之混匀。于 65温育 10min。加入等体积的氯仿异戊醇，轻轻颠倒混匀。4） 室温下 4000r/min 离心 10min，回收上层水相。在回收的上层水相中。5）.加入 2/3 体积预冷的异丙醇 (预冷至20)，轻轻混匀，置冰箱中放置数小时甚至过夜，使核酸沉淀下来。6） 室温下 4000r/min 离心 10min。7） 小心倒去上清液，用 80乙醇洗涤沉淀物。尽量沥干乙醇，置于真空干燥器内干燥，称重，计算产率。8） 将 D
5、NA 沉淀溶于 1mL TE 中。.PCR 检测方法： PCR 反应体系10buffer 2.5ul2mM dNTPs 2ulPrime 1 1ulPrime 2 1ul模板 1ulTaq 酶 0.5ulddH2O 补至 25ul PCR 运行程序94预变性 10min94变性 45sec54退火 45sec 35 个循环72延伸 2min72延伸 10min 琼脂糖凝胶电泳2.2 卡那霉素抗性筛选将导入目的基因的桉树幼苗或者愈伤组织转接到含有 km 的培养基上培养，通过观察其成活率确定目的基因是否成功转入。6、本课题的进度安排：1.第一、二周熟练掌握试验所需仪器的使用，并查找文献，设定试验方案。2.第三五周对芽直分培养基进行优化。3.第六八周对生根培养基进行优化。4.第九十一周对暗培养时间、侵染时间进行优化。5.十二十四周对导入基因进行检测，找出最优方法。6.五月底开始写毕业论文，六.
