1、 流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选 c k【摘要】 目的 比较流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选肝癌亚群细胞的效果。方法 原代培养肝细胞癌细胞，分别以流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选 c kit+肝癌细胞，然后使用流式细胞仪鉴定细胞纯度，计算回收率；以台盼蓝检测细胞活力，CCK 8 法检测细胞增殖能力，裸鼠移植测其成瘤率，并进行统计学分析。结果 流式细胞仪分选所得到的 c kit+肝癌细胞纯度、回收率最高，与其他两种方法分选所得细胞的相应指标比较，差异有统计学意义(P0.05)；3 种方法所得细胞之间的细胞活力、刺激指数、移植成瘤率比较，差异无统计学意义(P0.05
2、)。流式细胞仪分选前后的细胞之间活力、刺激指数比较，差异无统计学意义(P0.05)。结论 流式细胞仪分离法是分离肝癌亚群细胞的较佳方法。 【关键词】 流式细胞仪； 免疫磁珠； 亲和板结合分离法【Abstract】 Objective To pare the effect of three methods including floetry sorting, magic cell sorting and immune panning isolation in isolating sub-population in hepatoma carcinoma cells. Methods c kit p
3、ositive cells in primarily cultured human hepatoma carcinoma cells etry sorting, magic cell sorting and immune panning isolation, respectively. The purity, viabililty, cell proliferation and the ratio of tumorigenesis after transplantation of the hepatoma carcinoma cells ined etry, trypan blue exclu
4、sion, CCK 8 assay and allogeneic graft to nude mouse respectively. Then, the data etry sorting ethods, ulation index and tumorigenesis after transplantation among the cells isolated ethods (P0.05). There etry sorting (P0.05). Conclusions Floetry sorting is an effective and practical method for isola
5、ting sub population in hepatoma carcinoma cells.【Key etry; Magic cell sorting; Immune panning isolation肿瘤干细胞研究需要获取高纯度、高活力、高增殖能力的肿瘤亚群细胞，并尽量避免混杂细胞、低活力、低增殖能力细胞对细胞亚群特性的干扰。笔者在前期研究的基础上1，比较了流式细胞仪分选(floetry sorting，FCMS)、免疫磁珠分选(magic cell sorting ，MACS)及亲和板结合分离法(immune panning isolation) 3 种方法分选 c kit+肝癌细胞的
6、效果，以期找到一种分离肝癌亚群细胞的较佳方法，为肿瘤干细胞的研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本：取材于南方医科大学附属珠江医院 2006 年 4 月经手术切除的肝癌标本，经病理证实为原发性肝细胞癌。患者术前未进行任何抗肿瘤治疗，手术后患者 4 周内存活。1.1.2 实验动物：裸小鼠(BALB/c)75 只，雌雄兼用，35 周龄，质量 1020 g，由南方医科大学动物实验中心提供。1.1.3 主要试剂：低糖、胰蛋白酶、无钙镁离子的平衡盐溶液(D HankS 液，pH7.27.4)、细胞增殖试剂 CCK 8 购自美国Gibco 公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；兔抗
7、人 c kit 多克隆抗体、FITC 标记的羊抗兔 IgG(1200)购自丹麦 Santa Cruz 公司；抗兔 IgG1 免疫磁珠购自德国 Miltenyi Biotech 公司；其他常用试剂为国产分析纯。1.1.4 主要仪器：免疫磁珠分选磁力架、MS 磁性分离柱购自德国Miltenyi Biotec 公司；Epics Altra 型流式细胞仪购自美国 Beckman Coulter 公司；各种常用耗材购自广州威佳科技公司。1.2 方法1.2.1 分离、培养肝癌细胞：结合分离法，以兔抗人 c kit 多克隆抗体为一抗，FITC 标记的羊抗兔 IgG 为二抗，分选 c kit-细胞和c kit
8、+细胞。每种方法分选出 5 组细胞，进行如下检测。(1)细胞活力检测：采用台盼蓝排斥实验检测细胞活力并计算细胞存活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数) 100%。(2)细胞增殖能力试验：参照文献4的 CCK 8 法检测并计算细胞刺激指数(stimulate Index，SI)，SI=(实验孔 OD 值-空白孔 OD 值)/(阴性对照孔 OD 值- 空白孔 OD 值) 。(3)c kit+肝癌细胞的纯度：按流式细胞仪检测的要求，以兔抗人c kit 多克隆抗体为一抗，FITC 标记的羊抗兔 IgG 为二抗，各组细胞标记后上机检测 c kit+肝癌细胞的纯度。计算分选前、后 c kit+细胞的百分比。(4)计算细胞回收率：计算分选前后的细胞数，求出 3 种方法分选后的得率。(5)c kit+亚群肝癌细胞成瘤能力测定：
