1、核仁素蛋白调节 OLFM4mRNA 表达的研究安娜 1，吴莉雅 1，黄轶 2，蒋雪 1*，刘先俊 1*1 重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，分子医学与肿瘤研究中心，400016 重庆2 重庆医科大学附属儿童医院临床分子诊断中心，400014 重庆*通讯作者：蒋雪 邮箱： 电话：13883217678刘先俊 邮箱： 电话： 13193265086摘要 目的：探讨核仁素（nucleolin，C23 或 NCL）蛋白与Olfaetomedin4（OLFM4）mRNA 之间是否存在相互作用，以及核仁素对OLFM4 转录水平的调控。方法：本研究利用 RNA 染色质免疫共沉淀 （chrom
2、atin immunoprecipitation assay ，RNA Chip）结合 RT-PCR 确定核仁素是否能与 OLFM4mRNA 相互作用，以及荧光素酶报告基因试验检测核仁素对OLFM4 报告基因的影响。结果：在 SGC-7901 细胞内，核仁素能与OLFM4mRNA 结合，且核仁素对 OLFM4 具正向调节作用。结论：核仁素与OLFM4mRNA 可以相互结合，且核仁素可以通过增加 OLFM4 转录水平和延长OLFM4mRNA 的半衰期来增加 OLFM4mRNA 的稳定性。关键词 核仁素；OLFM4；RNA 染色质免疫共沉淀（RNA Chip） ；双荧光素酶报告基因试验The St
3、udy of Nucleolin protein regulating OLFM4mRNA ExpressionAn Na, Wu Liya, Huang Yi, Jiang Xue, Liu Xianjun Department of biochemistry and molecular biology, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016 Abstract Objective To explore the interaction between olfaetomedin4(OLFM4) mRNA and nucleolin pro
4、tein, and the regulatory of nucleolin protein on the Transcription level of OLFM4. Methods We performed chromatin immunoprecipitation assay （RNA chip）with RT-PCR to identify whether OLFM4 interacted with nucleolin, and the effects of nucleolin on the OLFM4 were detected by dual-luciferase reporter a
5、ssay. Results OLFM4 directly interacted with the nucleolin in SGC-7901 cells, nucleolin had positive moderating effect on OLFM4. Conclusion OLFM4 directly interacted with the nucleolin, and nucleolin stabilizes the OLFM4mRNA by Increasing OLFM4 transcription and extending OLFM4mRNA half-life.Key wor
6、ds OLFM4; nucleolin; RNA chip; Dual-luciferase reporter assayOlfaetomedin4（OLFM4）是在胃癌细胞特异高表达的分泌性糖蛋白分子，与肿瘤的恶性程度、侵袭及转移密切相关。OLFM4mRNA 在细胞内水平的改变，一定程度上可以反映细胞抗凋亡或进行凋亡的情况。而 OLFM4mRNA 水平的高低除了与转录的调控机制有关以外，也和 mRNA 降解机制有关 1，目前OLFM4 的研究尚处初期。核仁素（nucleolin, C23 或 NCL）是真核细胞核仁中最主要的一种磷酸蛋白质，与细胞的多种代谢过程有关。序列分析发现，核仁素包含三
7、个不同功能结构域，中间区含多个 RNA 结合结构域 2。目前报道证实，核仁素通过与mRNA3非翻译区（3-untranslation regions ，3UTR）富含 AU 的元件相互作用，增加抗凋亡蛋白 bcl-2、Bcl-XL 和 -球蛋白 mRNA 的稳定性 3-5。迄今为止，OLFM4 与核仁素的关系仍未得到证实。1 材料与方法1.1 材料人胃癌细胞株 SGC-7901 为本室保存。Tripure、脂质体 HP 为 Roche 公司产品，RT-PCR 反转录 Kit、DNA Marker DL2000 购自大连 TaKaRa 公司。双荧光素酶报告基因实验试剂盒购自 promega 公司
8、，蛋白抽提试剂 RIPA 购自上海申能博彩公司，细胞培养用 DMEM，胎牛血清为 TBD 公司产品，其余试剂均为国产分析纯。过表达核仁素质粒 GC146-Ncl 由上海吉凯生物技术公司构建，敲低核仁素质粒 pGenesil-1.1-Ncl 由武汉晰玛生物技术公司构建，报告基因质粒pmiR-RB-Report h-LOFM4 由广州市锐博生物科技有限公司构建。RNA CHIP-IT Magnetic Chromatin Immunoprecipitation 试剂盒够自 active motif 公司。核仁素（C23 ）抗体购自 Abcam 公司，鼠 IgG 抗体购自 Senta Cruz 公司
9、。引物由上海生工生物工程公司合成。1.2 方法1.2.1 荧光素酶报告基因实验荧光素酶活性用荧光素酶报告分析系统（promega）根据操作指南在酶标仪上分析。110 4 每孔的细胞到 96 孔板中，12 小时后，80ng 核仁素过表达质粒GC146-Ncl 或敲低质粒 pGenesil-1.1-Ncl 与 20ng 含萤火虫基因和海肾基因的报告质粒共转染，对照质粒 GV-142、pGenesil-1.1-HK 也分别与报告质粒共转染。转染 48 小时之后裂解细胞，检测萤火虫荧光和海肾荧光的表达情况，用两者的比值来评价核仁素对 OLFM4 基因表达的影响。1.2.2 细胞核染色质的分离 向 20
10、ml 无血清细胞培养液中加入 540l 甲醛，轻轻摇匀，室温放置 8 min弃去培养基，用冷 PBS 漂洗一遍，细胞固定后加入 1的甘氨酸，室温摇动孵育 5 min 后弃去，用 5 mL 冷 PBS（含 20l PMSF）刮细胞移人 15 mL 离心管中，43500 r/min 离心 10 min，弃上清。 1.2.3 细胞裂解和超声波破碎细胞核 每份样品中加人 1 mL 预冷的细胞裂解液（含 5l PIC、5l PMSF 和 1l RNase inhibitors） ，充分混匀，冰上裂解 30min，4 5000 r/min 离心 10 min，弃去上清；加入 350l 超声破碎缓冲液（含
11、1.75l PIC 和 0.5l RNase inhibitors）混匀，超声强度：40%功率，每次 1 S， 间隔 30 s，执行 30 次，然后 12 000 r/min，4 离心 10 min，将染色质打断成 1000bp 以下的片段，取 50l 染色质提取 RNA，测定浓度并用琼脂糖凝胶电泳检测剪切结果。 1.2.4 染色质免疫共沉淀 向上述 2 份 10g 染色质 中加预先洗过的磁珠 25l、10l 或者 15l RNA-IP buffer、0.5 l RNase inhibitors、1l PIC，一定量的 DEPC 水至最终体积为 100l 或者 150l ，最后分别加入 4l
12、C23 抗体和 10l IgG 抗体，混匀，37 上下颠倒孵育 4h 后，4过夜。1.2.5 蛋白质-RNA 复合物的洗脱和去交联 吸去上清，用 Wash buffer1 洗四遍，Wash buffer2 洗两遍后，加入 100l Elution buffer（含 0.1l RNase inhibitors） ，室温下 上下颠倒孵育 15min，吸取上清，加入 2l 5M NaCl 和 2l proteinase K 到每个样本中， 42孵育 1h 消化蛋白，65孵育 1.5h 反向交联。1.2.6 RNA 纯化和逆转录加入 150l DEPC 水和 750l Tripure，再加入 200l
13、 氯仿剧烈震荡 15S，室温放置 15min，412 000 g/min 离心 10min，将含上层 500 l 移人新管中，加等体积异丙醇，混匀放置 15min，412 000 g/min 离心 10min 沉淀 RNA，弃去上清后加 1 mL 75%乙醇，混匀， 7500 g/min 离心 5rain，弃上清，空气中干燥至少 5min，加 DEPC 水溶解 RNA，检测浓度。取一定量的 RNA 逆转录成cDNA。 1.2.7 PCR 检测 所用 OLFM4 的上游引物：5-CGT GGA TGA CCG TGG GAC CTG -3，下游：5 -AGG GTG GAC GAC AGG GG
14、T GTT -3。扩增条件为：94 预变性2min，9430 S，5820 S，72 30S，40 个循环，72延伸 2 min取 5 l PCR 产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测正常小鼠 IgG 作为阴性对照。免疫共沉淀之前稀释的染色质作为内对照。1.3 统计学处理 采用 SPSS17.0 软件进行分析，组间差异采用独立 T 检验分析，双侧检验P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 核仁素对 OLFM4 活性的影响OLFM4-报告基因质粒分别与过表达、敲低 OLFM4 质粒及其对照组质粒共转染，48h 后，检测样本萤火虫和海肾荧光素报告基因荧光强度的绝对比值。过表达质粒 GC146-Ncl
15、 的相对荧光素酶活性约为对照质粒的 1.15 倍，两组相比P0.05 （t=3.420） ； 敲低质粒 pGenesil-1.1-Ncl 的相对荧光素酶活性约为对照质粒的 0.8 倍，两组相比 P0.05（t=3.408） （图 1） 。 该结果从正反两面显示核仁素对人 OLFM4 基因的转录具有正向调节作用。图 1：调节核仁素的变化对 OLFM4 的影响 与阴性对照比较，* P0.052.2 SGC-7901 细胞株胞核染色质切割有效性的确定为得到合适大小的 RNA 片段，摸索了各种超声波破碎条件，最终确定了合适的超声波破碎条件：即输出功率 40%，每次 1 S，间隔 30s，共 30 次(
16、图 2)。图 2：琼脂糖电泳检测超声打断染色质效果图 2.3 OLFM4 与核仁素结合鉴定 抗核仁素抗体免疫沉淀染色质片段，提取 RNA，以逆转录成的 cDNA 为模版，PCR 扩增 OLFM4 基因 490bp 片段（324813） ，结果显示模版中含有被扩增区段 cDNA，而 control-IgG 染色质却没得到扩增（图 3） 。 图 3：RNA 染色质免疫共沉淀的 PCR 结果分析3 讨论本实验经双荧光素酶报告基因检测发现：转染 GC146-NCL 后，与对照组相比 OLMF4 报告基因的活性显著增强；反之，转染 pGenesil-1.1-Ncl 后，与对照组相比 OLMF4 报告基因
17、的活性显著减弱，均有统计学意义。表明核仁素能调节 OLFM4mRNA 的转录水平。并应用 RNA-CHIP 技术结合 PCR 扩增的方法发现人胃癌细胞 SGC-7901 中 OLFM4mRNA 能与核仁素蛋白结合。应注意的是，双荧光素酶报告基因检测系统只能对感兴趣分子群的功能进行初步、快速地筛选，其生物学功能的确认尚需通过电泳迁移率变动分析(EMSA)直接检测转录因子的活化情况，以及应答基因在 mRNA 水平、蛋白水平的变化需要进一步验证 6。RNA-CHIP 与 CHIP 类似，用于研究 RNA 在基因表达调控中的作用 7。该IgG M C23 input490bpM 未超声 15 次 30
18、 次20001000250100bp500技术在国外已经得到了广泛应用，但在国内还鲜有报道。在我们的 RNA-CHIP试验结果中，核仁素能与 Bcl-2mRNA 作用（结果中未显示） ，与已有的报道 3相符。故经过本实验证实 RNA-CHIP 技术可以用来研究已知蛋白的未知 mRNA靶点。核仁素主要位于细胞核，在生长细胞和肿瘤细胞中表达丰富 8。其氨基酸顺序揭示，它含有三个不同的结构域：N 末端结构域、中间结构域和羧末端结构域。中心结构域含有 4 个 RNA 结合结构域命名为 RBD 或 RRM 结构域，负责与 RNA 相互作用 9。核仁素能参与调解 rRNA 的转录，核蛋白体的生物形成，10
19、它是转录因子 LR1、Myb 的组成成分，参与多种基因转录的调节 4。核仁素具有能识别 RNA 的特殊序列，是一种小的茎-环结构，该结构存在于所有的rRNA 前体，被称为核仁素识别元件（nucleolin recognition element, NRE） ，其核心序列为（U/G）CCCG(A/G) 11，这个核心序列能与 mRNA 中富含 AU 的元件结合 4，从而阻断 AREs(mRNA3端非翻译区富含 AU 顺式元件区域)加速降解 mRNA 的过程，延长半寿期，增加其翻译水平，从而增加细胞内相应蛋白质的水平 12。目前的研究已揭示核仁素能影响多种 mRNA 的稳定性。OLFM4，最初被克
20、隆于人的原始粒细胞，编码一种 510 个氨基酸的分泌型糖蛋白。OLFM4 在胃癌的研究最先是通过串联分析寻找胃癌特异性标志物时发现的。与正常组织相比，OLFM4 在胃癌中高表达，能促进肿瘤细胞生长，具有抗凋亡作用。 13我们通过生物信息学分析发现 OLFM4mRNA 存在类似富含 AU元件能结合核仁素的序列，但核仁素是否能与我们关心的 OLFM4 作用仍不得而知。我们通过 RNA-Chip 实验得到的结果中，发现核仁素能与 OLFM4mRNA结合。由此，我们推断：核仁素一方面通过促进 OLFM4 的转录，增加细胞内OLFM4mRNA 水平；另一方面核仁素作为 AUBP(AU 富含区结合蛋白)与
21、OLFM4mRNA 3端不翻译序列结合，增加 OLFM4mRNA 的稳定性，导致肿瘤细胞产生抗凋亡作用，促进胃癌细胞生长。mRNA 稳定机制十分复杂，目前主要认为与5 -帽结合蛋白，编码区结合蛋白，3 -UTR 结合蛋白，poly（A）结合蛋白等有关 14。尽管本研究也明确了核仁素通过结合 OLFM4mRNA3端不翻译区延长其半寿期，增加 OLFM4mRNA稳定性，但是目前只是停留在对现象的观察，至于核仁素结合 OLFM4mRNA 3UTRs后如何增加它的稳定性，是否与富含 AU 顺式元件结合因子1（A+U-rich element-binding factor 1, AUF1） 15等有关，
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