1、 苦参碱对肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞的影响作者：皇甫超申，刘彬，耿旭，房娜，谷敬丽 【摘要】 目的: 研究不同浓度苦参碱对肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)增殖、体外杀瘤活性的影响. 方法: 将苦参碱分为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L 5 个浓度组，分别加入含有 IL2 的DMEM 培养基，体外诱导扩增 TIL,通过 MTT 法检测 TIL 增殖、体外杀瘤活性，采用流式细胞术测定 T 淋巴细胞亚群，研究苦参碱体外对肿瘤免疫功能的影响. 结果：苦参碱低浓度组（终浓度分别为0.1，0.2 g/L）对 TIL 作用不明显, 高浓度组（终浓度为 0.8 g/L）能抑制 TIL 增殖和体外
2、杀瘤活性 (P0.01)，中浓度组（终浓度分别为0.4, 0.6 g/L）能促进 TIL 增殖和体外杀瘤活性(P0.01)，CD8+数量有所增加，CD4+/CD8+比值有所下降(P0.01). 结论: 合理利用苦参碱可增强患者肿瘤免疫能力. 【关键词 】 苦参碱; 淋巴细胞,肿瘤浸润;癌，肝细胞 【Abstract】 AIM: To explore the effect of different concentrations of matrine on proliferation and activity of tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) of pa
3、tients with hepatocellular carcinoma in vitro. METHODS: Different concentrations of matrine (0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g/L) were respectively added into DMEM medium supplemented with IL2. The effect of matrine on proliferation and activity of TIL in vitro was studied by MTT, and the Phenotype was dete
4、cted by flow cytometry (FCM). RESULTS: The lower concentration of matrine (0.1, 0.2 g/L) had no effect on TIL. High concentration of matrine (0.8 g/L) had a remarkable inhibitory effect on proliferation and antitumor activity of TIL (P0.01). The middle concentration of matrine (0.4, 0.6 g/L) enhance
5、d the proliferation and antitumor activity of TIL in vitro (P0.01). The percentage of CD8+ increased and the ratio of CD4+/CD8+ decreased (P0.01). CONCLUSION: The reasonable use of matrine could enhance the patients specific antitumor immune function. 【Keywords 】 matrine; TIL; hepatocellular carcino
6、ma 0 引言 苦参碱作为一种传统的中药成份，可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和分化，调节肿瘤宿主免疫功能，目前已成为抗癌中药研究的一个热点. 但有关苦参碱对免疫功能的影响目前存在很多争议1. 且相关研究多以患者外周血单个核细胞、淋巴器官内淋巴细胞、血清淋巴因子为研究对象，未见有关苦参碱对宿主抗肿瘤细胞免疫的主力肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte,TIL）抗瘤活性及机制的研究报道. 为此，我们选择从肝癌患者新鲜肿瘤组织中分离的 TIL 为研究对象，探讨苦参碱对其抗瘤活性的影响及可能机制. 1 对象和方法 1.1 对象 肝癌患者 13 例（男 10，女
7、 3），平均年龄 45.6（3758）岁. 手术切除的瘤体平均直径 5.2 cm，病理学诊断均为原发性肝细胞肝癌. 苦参碱购自西安天琪植物化学有限公司，分子质量 248.37，纯度大于98%，临用前用 PBS 配成工作浓度 . IL2, 刀豆蛋白 A(ConA), DMEM 培养液、MTT，型胶原酶(美国 Sigma 公司).胎牛血清（华美生物工程公司），淋巴细胞分离液(上海试剂二厂). 1.2 方法 1.2.1 肝癌细胞和 TIL 分离、表型鉴定无菌切取新鲜人肝癌标本，剪碎，1 g/L 型胶原酶消化，过滤，制成细胞悬液，用淋巴细胞分离液，不连续密度梯度分离法分离出 TIL 和肝癌细胞. 瑞氏
8、染色鉴定. 肝癌细胞常规培养. TIL(5108 个/L)加入含 rhIL2 5 U/L 的培养液中，试验组加入苦参碱，分低浓度组（终浓度分别为 0.1,0.2 g/L）中浓度组（终浓度分别为 0.4, 0.6 g/L）高浓度组（终浓度为 0.8 g/L），空白对照组不加苦参碱，只加等量的培养液，体外扩增 2 wk. T 淋巴细胞亚群测定采用流氏细胞术（FACSCalibur）,淋巴细胞三色荧光标记，试剂由美国 Beckman coulter 公司提供 . 1.2.2 苦参碱对TIL 体外扩增作用根据 IL2 诱导 TIL 增殖情况，选用 1 U/L IL2作为应用浓度，将含 IL2 的 TI
9、L 细胞悬液（ 5108 个/L ，100 L/孔）加入 96 孔平底培养板中，试验组加入苦参碱（终浓度分别为0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g/L）每孔 100 L/孔. 空白对照组不加苦参碱，只加等量的培养液. 每组设 3 个复孔. 每 2 d 记数 1 次. 记数后再调整细胞密度为 11010 个/L, 继续培养. 1.2.3 淋巴细胞转化试验(MTT 法)试验组为含 5 g/ L ConA 的 TIL 悬液, 加入苦参碱溶液, 使其终浓度分别为 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g/L,阳性对照组仅含 5 g/L ConA, 空白对照组为加入等体积 PBS
10、 溶液的 TIL 悬液. 将上述细胞悬液分别加入到 96 孔细胞培养板中, 每孔 200 L,各组均设 6 个复孔. 96 孔培养板置 37, 50 mL/L CO2 孵箱中培养 72 h 后, 离心弃上清液, 再加入培养液 150 L 和 5 mg/L MTT 溶液 20 L, 继续培养 4 h. 培养结束后每孔加入 150 L 二甲基亚砜, 振荡 2 min 溶解沉淀, 混匀后以酶标仪读取各管 A570 nm 值. 计算刺激指数(SI). SI(%)=(实验孔 A570 nm 均值/ConA 孔 A570 nm 均值)100% 1.2.4 苦参碱对TIL 细胞体外杀伤肿瘤细胞的影响将 TI
11、L 作为效应细胞，试验组取上述不同浓度苦参碱作用过的 TIL,用培养液洗涤 3 次，空白对照组用未经苦参碱作用的 TIL. 原代培养的自体肝癌细胞为靶细胞，按效靶比 201 的比例，取 1105 个 TIL 约 100 L 与肝癌细胞 5103 个约 100 L 混合加入 96 孔板中，每组样品设 3 个复孔. 将培养板置饱和湿度、37, 50 mL/L CO2 孵箱内培养 20 h，每孔加入 5 g/L MTT 20 L,继续培养 4 h，离心、弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO） 200 L,震荡 5 min，用酶联免疫检测仪测 A570 nm 值，计算杀伤率. 杀伤率（%）=（A 靶+
12、A 效）-A(效+靶)/A 靶100% 统计学处理: 实验结果以 xs 表示,用 SPSS 10.0 对多组间比较进行方差分析，两两比较用 Dunnett t 检验. 2 结果 2.1 苦参碱对TIL 体外增殖的作用 2.1.1TIL 体外增殖计数对照组和低浓度组TIL 在体外培养的初期 7 d 无明显生长,渡过此生长抑制期后, TIL 扩增, 14 d 扩增 23 倍 . 中浓度组 TIL 在培养的第 4 日开始生长,14 d扩增近 50 倍. 高浓度组 TIL 在培养的第 7 日开始生长, 14 d 扩增近1 倍. 空白对照组和低浓度组 TIL 悬液中的肿瘤细胞,在培养的第 4日开始死亡,
13、至第 14 日基本全部消失. 中浓度组和高浓度组 TIL 悬液中的肿瘤细胞在培养的第 2 日开始死亡,至第 5 日全部消失(瑞氏染色法检测). 2.1.2TIL 体外增殖活性苦参碱在低浓度条件下对 TIL增殖抑制作用不明显，在高浓度条件下对 TIL 增殖有抑制作用，中等浓度条件下对 TIL 增殖有促进作用（表 1）.表 1 苦参碱对 IL2诱导 TIL 体外增殖的作用 (略) 2.2 苦参碱对 TIL 亚群增殖的影响新分离的 TIL 主要为 CD3+细胞（64.11 3.84）, CD3+CD4+ (30.121.40), CD3+CD8+(28.311.62), CD4+/ CD8+(1.2
14、10.24). 苦参碱在中等浓度条件作用下,CD4+细胞下降，CD8+ 上升，CD4+/ CD8+降低，在低浓度、高浓度、空白对照组 T 细胞各亚群比例变化不明显（表 2）.表2 苦参碱对 TIL 亚群增殖的影响 (略) 2.3 苦参碱对 TIL 细胞体外杀伤肿瘤细胞的影响空白对照组 TIL 对肿瘤细胞杀伤率为 48.63.2, 与此相比， 苦参碱在低浓度条件下并不能提高 TIL 增体外杀瘤活性(杀伤率分别为 50.82.9，49.72.5，P0.05)，在高浓度条件下对TIL 杀瘤活性有抑制作用( 杀伤率为 37.22.5, P0.05)，中等浓度条件下对 TIL 杀瘤活性有促进作用（杀伤率
15、分别为69.41.6，72.22.0），中等浓度苦参碱作用 TIL 对肿瘤细胞半数致死时的药物浓度（IC50）0.35 g/L (P0.01). 3 讨论 免疫系统作为机体抗肿瘤的第一道防线,在恶性转化细胞的识别和清除过程中发挥着重要作用,荷瘤宿主自身免疫状态的好坏与肿瘤的发生、发展及预后密切相关. 许多具有抗肿瘤作用的中药都可通过改善荷瘤机体的免疫功能低下状态而发挥抑瘤活性. 许多试验表明苦参碱具有免疫调节功能. 一些研究认为苦参碱通过抑制巨噬细胞的吞噬功能、LAK 细胞的活性和 T 细胞增殖而发挥免疫抑制作用3. 另一些实验认为苦参碱有促进肿瘤宿主的抗肿瘤免疫反应功能, 特别是以细胞毒性
16、T 细胞(CTLs)为免疫效应子的免疫反应是机体抗肿瘤的主要防御机制,它的有效激活可明显改善肿瘤的预后4. 用氧化苦参碱喂饲荷瘤小鼠,发现实验组小鼠较对照组瘤体明显减小,而实验组小鼠 NK 细胞、胸腺有核细胞增多 ,血中 IL2 活性增强5. 我们的试验结果显示，低浓度苦参碱对 TIL 增值、表型、体外抗瘤活性几乎不起作用，高浓度苦参碱对 TIL 增值、体外抗瘤活有抑制作用，只有在中等浓度下，苦参碱才表现出协同 IL2 刺激 TIL 增值、提高体外抗瘤活的作用. 提示苦参碱对肿瘤免疫的调节具有双向性. 我们的试验结果与文献差异，说明研究对象不同、研究方法不同，从而使实验结果缺乏可比性. 文献多
17、采用肿瘤患者外周血淋巴细胞为研究对象，有人选用的药物是氧化苦参碱，具体试验步骤差异很大，所以得出的结果不同. 肿瘤微环境中招募的 TIL 抗肿瘤作用已被许多试验证实6. 以 TIL 为研究对象，可以更好地揭示苦参碱对肿瘤免疫的作用. 一般认为 CD8+淋巴细胞中的 Tc 亚群在 CD4+辅助下，被肿瘤抗原信号刺激分泌淋巴因子，自身被激活，在肿瘤局部发挥细胞毒性作用，从而特异性杀伤肿瘤细胞. 肿瘤组织中 CD8+数量愈多，患者预后愈好7. 我们新分离的 TIL CD4+/CD8+比值为 1.210.24，说明肿瘤局部细胞免疫被抑制. 低浓度苦参碱对患者 TIL 作用不明显的机制可能是对细胞分化不起作用，也不足以引起细胞凋亡. 高浓度苦参碱可抑制细胞增值，促使细胞凋亡，从而抑制 TIL 体外扩增，使其数量减少，抗肿瘤效应减低. 经中等浓度苦参碱与 IL2 共同作用 96 h，CD8+数量有所增加，CD4+/CD8+比值有所下降. 说明中等浓度苦参碱增强肿瘤细胞免疫的机制主要是刺激 CD8+细胞分化. 提示合理利用苦参碱，可增强患者肿瘤免疫能力. 基金项目：河南省科技攻关项目（0124170229） 【
