1、 基于 SP 细胞分选法初步鉴定卵巢癌干细胞表面标志作者：张弦 蒋翠莲 王宝偲 刘蔷 左鹏飞 赵枫姝 窦骏【摘要】 目的： 基于侧群（SP）细胞分选方法，初步鉴定卵巢癌干细胞（CSC) 表面标志，为临床靶向治疗卵巢癌提供靶分子。方法： 检测、分离卵巢癌细胞株 A2780 中的 SP 细胞，并对 SP 与NonSP 细胞作细胞生物学鉴定，包括克隆形成能力、致瘤能力、耐药性、定量 ATP 结合框蛋白家族 G2 蛋白 (ABCG2)检测等；进一步用免疫磁选方法筛出 ABCG2+及 ABCG2-细胞，同样作上述细胞生物学鉴定，探讨 ABCG2 分子能否作为卵巢 CSC 的表面标志。结果： 卵巢癌 A2
2、780 细胞株中的 SP 细胞在体外强克隆形成能力、裸鼠体内的高致瘤性、对化疗药物长春新碱较强耐受性及高表达ABCG2 分子等生物学特性基本符合 CSC 的特征。ABCG2细胞的克隆增殖能力略强于 ABCG2-细胞；ABCG2+细胞的耐药性与 SP 细胞的耐药性一致。结论： A2780 细胞株中的 SP 细胞基本符合 CSC的生物学特征，其高表达的 ABCG2 分子参与维持 SP 细胞表型，特别是多药耐药性。ABCG2 分子可作为靶向治疗 CSC 的靶分子，逆转肿瘤的多药耐药性。 【关键词】 侧群细胞 卵巢癌 癌干细胞 ABCG2 分子 靶向治疗 Abstract： Objective To
3、explore a target molecule for the clinical targeted therapy of ovarian cancer. Methods The SP cells and non SP cells were isolated respectively from the human ovarian cell 2780 strain by fluorescence activated cell sorting (FACS) and their biological characteristics were identified by analysis of th
4、eir ability to form colonies in common media, tumorigenicity in Balb/c nude mice, and of their resistance to chemotherapeutic agents vinblastin. The expression of ABCG2 was detected with realtime quantitative RTPCR (qRT PCR). The specific ABCG2 phenotype cells were further isolated from the ovarian
5、cell A2780 strain for the same identification as above by the monoantibody labeled with immune magnetic beads by magnetic activated cell sorting system. Results The SP cells proliferative potency, clone formation ability in the common media, the tumorigenicity in Balb/c nude mice, and resistance to
6、vinblastin in vitro were basically coincident with characteristics of cancer stem cells（CSC）. The ABCG2cells proliferative potency and resistance to vinblastin in vitro were higher than those of the ABCG2-cells. Conclusion The SP cells in the ovarian cell 2780 strain possess the traits of ovarial CS
7、C and expressed ABCG2 molecule maintains the SP cells phenotype, especially in multidrug resistance. The ABCG2 molecule may be responsible for target molecule of the targeted therapy of ovarian cancer and for inversion of multidrug resistance in ovarian cancer.Key words：side population cells; ovaria
8、n cancer; cancer stem cells; ABCG2 molecule; target therapy 卵巢癌是女性生殖器官常见肿瘤，发病率在妇科恶性肿瘤中列居第三，但其致死率却为各类妇科肿瘤之首1，因此，探索治疗卵巢癌的新途径，已成为进一步提高卵巢癌患者生存率的关键。随着干细胞(stem cells, SC)研究的深入，人们发现肿瘤是一种 SC 疾病。许多证据表明，大多数的肿瘤组织中存在着具有 SC 特征的“起始肿瘤细胞”(tumor initial cells, TIC)，称为癌干细胞(cancer stem cells, CSC)，其是肿瘤增长、耐药及复发的根源2。分离与
9、鉴定是 CSC 研究的第一步，由于 CSC 缺乏已知的统一特异性标记，分离和鉴定成为 CSC 研究的难点。本研究主要通过侧群（side population，SP）细胞分选结合结合框蛋白家族2 蛋白（binding cassette G2, ABCG2)等方法初步研究卵巢 CSC，其中 SP 细胞是指可将荧光染料 Hoechst33342 泵出细胞外、表现弱荧光信号的细胞群，占总体细胞的很少部分3。在缺乏显著 CSC 分子标记的情况下，SP 细胞的筛选分析可以作为 CSC 鉴定的一种实用而简易的重要方法4。1 材料与方法1.1 动物及细胞株Balb/c 系的 46 周雌性裸鼠，购于上海动物模式
10、中心。人卵巢癌细胞株 A2780 购于南京中医药大学，于加 10%新生小牛血清的1640 培养液中，在 37 、5%CO2 环境下培养。1.2 实验方法1.2.1 A2780 细胞中 SP/NonSP 细胞流式检测和分选实验取对数生长期的单层培养细胞，制成单个细胞悬液，实验组加入 Hoechst33342 至终浓度 5 gml-1，对照组再加入 Verapamil 至终浓度 50 gml-1，37 水浴 90 min，重悬于冰冷的含 2%小牛血清的PBS 中，上流式细胞分选仪(fluorescence activated cell sorting, FACS)检测。以 355 nm UV 激发
11、光源、610 nm 双色短通反射滤镜、450 nm 和 675 nm 边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号，将细胞中荧光信号分为两个部分，以 Hoechst 红点为 X 轴，Hoechst 蓝点为 Y 轴作二维散点图，将低 Hoechst 红点及低 Hoechst 蓝点且对照组缺失的区域设定为 SP 细胞的“门” 5，将只加入 Hoechst33342 的实验组细胞分选出 SP 细胞及NonSP 细胞。1.2.2 克隆（集落）形成实验1.2.2.1 平皿克隆形成实验将分选的 SP 及 NonSP 细胞悬液按每皿含 100 个细胞接种于培养皿中。在 37 、5%CO2 环境
12、下培养。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养，甲醇固定，姬姆萨染液染色后计数，用肉眼直接计数克隆数，或在显微镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。按公式“克隆形成率 =克隆数/接种细胞数100%”计算克隆形成率。1.2.2.2 软琼脂克隆形成实验24 孔培养板中每孔分别浇入含 0.5%低熔点琼脂的底层琼脂0.8 ml 以及含 0.3%琼脂和一定细胞密度（分别含有 100 个细胞）的上层琼脂 0.8 ml，置于室温使琼脂凝固。在 37 、5%CO2 及饱和湿度环境下静止培养。第 10 天镜下计数直径大于 75 m 或含 50 个细胞以上的克隆，并计算克隆形成率。1.2.3 裸鼠体内致瘤实验1.2
13、.3.1 SP/Non SP 细胞裸鼠体内致瘤实验46 周龄 Balb/c 系雌裸鼠随机分为 SP 细胞组及 NonSP 细胞组，每组 3 只裸鼠，背部皮下注射对应的细胞悬液 100 l 5104个细胞，随后监测各组小鼠肿瘤生长时间。1.2.3.2 ABCG2+/ABCG2- 细胞裸鼠体内致瘤实验46 周龄 Balb/c 系雌性裸鼠随机分为 ABCG2+细胞组及ABCG2-细胞组，每组 6 只，背部皮下注射对应的细胞悬液 100 l 5104 个细胞，随后监测各组小鼠肿瘤生长时间。1.2.4 MTT 法检测 SP 和 NonSP 细胞对长春新碱耐受性取分选得到的 SP/NonSP 细胞接种于
14、96 孔板，实验组加入浓度为 10 gml-1 的长春新碱溶液 10 l 至终浓度 0.5 gml-1， 培养 72 h 后 MTT 法检测细胞的存活率。1.2.5 实时荧光定量 PCR 检测 SP/NonSP 细胞 ABCG2 基因表达检测 ABCG2：PCR 上游引物5GGCAGATGCCTTCTTCGTTATGATG3，下游引物5TGGTTGTGAGATTGACCAACAGACC3。 检测 actin：PCR 上游引物 5GGACTTCGAGCAAGAGATGG3，下游引物 5AGCACTGTGTTGGCGTACAG3。反应体系置入 ABI 7300 RealTime PCR 仪按如下程
15、序进行PCR 扩增：94 预变性 4 min，进入 3 步循环(94 30 s，57 30 s，72 35 s ，共 45 个循环)，在 3 步循环中的每个反应循环结束时，RealTime PCR 仪记录 SYBRGreen释放的荧光。以逆转录合成样品的 cDNA 产物作为模板，按相同的反应体系进行目的基因ABCG2 和内参 actin 的 Real TimePCR 扩增反应，并以 ddH2O为模板设阴性对照，电脑采集每个循环的数值。使用 7300 System SDS Software 进行数据分析和统计学处理。1.2.6 利用免疫磁选技术分离获取 ABCG2+表型细胞制备 A2780 单细
16、胞悬液，每 107 个细胞加 20 l 一抗，混匀后612 孵育 1015 min。每 107 个细胞再加 20 l 磁珠二抗，混匀后 612 孵育 15 min 或冰育 2030 min。然后用 1000 l 缓冲液洗涤细胞两次以去除多余的抗体，每 107 个细胞重悬于 100 l Buffer 中过柱，在磁场力的作用下，未能标记上 ABCG2 分子抗体的细胞不会在磁场中停留，用 1500 l Buffer 冲洗柱子。收集阴性细胞培养，移开分离柱收集阳性细胞。1.2.7 ABCG2+/ABCG2-/经抗体孵育 ABCG2+细胞对长春新碱耐受性取分选得到的 ABCG2+/ABCG2-，接种于
17、96 孔板，实验组加入浓度为 10 gml-1 的长春新碱溶液 10 l 至终浓度 0.5 gml-1，经抗体孵育 ABCG2+细胞组同时加入 ABCG2 单抗 2 l孔-1，培养 72 h 后 MTT 法检测细胞的存活率。 2 结 果2.1 SP/NonSP 细胞流式检测、分选及细胞生物学功能的鉴定FACS 检测出 A2780 细胞中的 SP 细胞比例约为 2.6%（B 值2.7%减去 A 值 0.1%，图 1）。将图 1B 中门区域的细胞分选下来，分选所得的 SP/Non SP 细胞分别行相关的细胞生物学鉴定。克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一6，常见的方法有平板克隆（图 2
18、A）和软琼脂克隆（图 2B）形成实验。本实验显示，SP 细胞的平板克隆率及软琼脂克隆率均明显高于 NonSP细胞（图 2C），两者差异有统计学意义（P 0.01）。在软琼脂克隆实验中 SP 细胞多为克隆球形式存在，而 NonSP 细胞则很难形成克隆球，多以散在细胞存在（图 2B）。裸鼠体内致瘤实验中，2周内 SP 细胞组 2 只裸鼠长出了肿瘤 (2/3)，NonSP 细胞组在 8 周后仍无肿瘤生长（0/3），余鼠在 10 周后均无肿瘤生长(图 2D)。 SP/NonSP 细胞对长春新碱耐受性实验中， 0.5 gml-1 浓度长春新碱作用于这两种细胞 72 h，用 MTT 法检测发现，对 SP
19、细胞的生长抑制作用不明显，其存活率约为 81%，而对 NonSP 细胞的抑制作用明显，其存活率仅为 37%，差异有统计学意义（P0.01，图 3）。用定量 RTPCR 检测 SP 细胞与 NonSP 细胞 ABCG2 表达量，结果显示，SP 细胞约是 NonSP 细胞的 5.8 倍（图 4）。2.2 A2780 细胞中 ABCG2+/ABCG2-细胞生物学鉴定首先利用免疫磁珠分离技术获取 A2780 细胞中的 ABCG2+表型细胞，1107 个 A2780 细胞可得到约 2105 个 ABCG2+细胞，即 A2780 细胞中 ABCG2+表型细胞占 2%左右，其含量与 SP 细胞的比例相似。将
20、分选所得的 ABCG2+/ABCG2-细胞行相关的细胞生物学特性鉴定，在细胞体外克隆形成实验中，ABCG2+细胞在平板克隆率及软琼脂克隆率均略高于 ABCG2-细胞（图 5），但差异无统计学意义（P 0.05)。在裸鼠体内致瘤实验中， ABCG2+细胞组在细胞接种后 5 周时 6 只裸鼠中 2 只长出了肉眼可见的肿瘤(2/6)， ABCG2-细胞组在细胞接种后第 5 周时 6 只裸鼠中 1 只长出了肉眼可见的肿瘤(1/6) ，其余鼠在接种后 10 周始终没有肿瘤的生长，两组间差异无统计学意义。分别将 A2780 细胞株分选的 ABCG2+/ABCG2-、ABCG2+加抗体孵育的各组细胞进行长春
21、新碱耐受性比较，发现药物对 ABCG2+细胞的生长抑制不明显，其细胞存活率约为 79%，而对 ABCG2-细胞组的生长抑制明显，其细胞存活率仅为 35%，对ABCG2+细胞且加入抗 ABCG2 抗体共同培养组的细胞生长抑制也很明显，其细胞存活率约为 38%，较未加抗体组明显下降，反映了ABCG2 分子可能介导了细胞对药物的耐受（图 6）。 3 讨 论分离与鉴定是 CSC 研究的第一步，由于多数 CSC 缺乏明确的特异性标记，分离和鉴定成为 CSC 研究的难点。目前，从形态学上很难区分 CSC 与肿瘤细胞间的差异，只能用功能学方法即从其自我更新能力和分化潜力来鉴定 CSC。分离 CSC 主要有：
22、SP 细胞分选、无血清培养富集干细胞及通过 CSC 表面特异性标志筛选 3 种方法7。其中 SP 细胞是 1996 年 Goodell 等3在用 Hoechst33342染色法研究全骨髓时，发现有极少一部分细胞可以将进入细胞核的荧光染料排出胞外，在荧光显微镜下观察或流式细胞仪检测时表现为不着色，他们将这类细胞命名为“SP”细胞，将这种表型命名为“SP表型”，该表型细胞还表达干细胞标志 Sca1+ Linneg/low。现发现SP 细胞广泛存在于多种生物的多种正常组织中，并同时存在于多种肿瘤细胞系及肿瘤组织中89。随着对 SP 细胞研究的深入，发现 SP 细胞的功能与正常干细胞相似，如 SP 细
23、胞可发生不对称分裂、进行自我更新等10。多项研究表明，部分肿瘤(乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤等)中 SP 细胞具有 CSC 特性，即表达干细胞相关表面标志，具有自我更新、强致瘤能力和高表达转运蛋白 ABCG211等。研究显示，在卵巢癌细胞中存在致瘤性较强的 SP 细胞1213，因此，我们利用 SP 细胞与干细胞、 CSC 具有许多共性的特点来探讨 SP 细胞分选法能否作为卵巢 CSC 分离鉴定的有效方法，并以此为基础初步研究卵巢 CSC 表面特异性标志。本研究的结果显示，卵巢癌 A2780 细胞株中的确有 SP 细胞存在，虽然仅占很少部分（约 2.6%），但其较强的克隆形成能力、致瘤能力、耐药性
24、及 ABCG2 基因表达显示，SP 细胞的生物学特性基本符合 CSC 的特征。本研究使用实时荧光定量 PCR 检测结果显示，SP 细胞中ABCG2 分子的表达量明显高于 NonSP 细胞，因此我们推测ABCG2 分子可能是卵巢 CSC 表面的一个特异性分子标志。ABCG2分子属 ATP 结合框转运体(ATPbinding cassette transporter, ABC)家族所介导的肿瘤细胞多重耐药分子家族中的一种，属跨膜药物转运蛋白，是抗肿瘤药物难以发挥效应的关键耐药蛋白1417。本研究发现，ABCG2+细胞的体外克隆能力及裸鼠体内致瘤能力仅略高于 ABCG2-细胞，差异无统计学意义，说明
25、 ABCG2 分子的高表达与卵巢 CSC 的强细胞增殖能力无明显关系，维持卵巢 CSC 高增殖能力的特性可能还有其它分子参与，如其它干细胞标志等还需进一步研究。而 ABCG2+细胞对化疗药物的耐受能力则明显高于ABCG2-细胞，且 ABCG2+细胞加入 ABCG2 单克隆抗体孵育后能使ABCG2+细胞对化疗药物的耐受性明显降低，说明 ABCG2 分子是参与维持卵巢癌细胞多药耐药性的一个主要分子标志。综上所述，卵巢癌 A2780 细胞株中的 SP 细胞符合 CSC 的特性，分离 SP 细胞能够富集卵巢 CSC，这为下一步研究 CSC 的特异性标记奠定了基础，并为开展对卵巢 CSC 药物防治，尤其是为有效的靶向治疗等研究提供了科学的实验依据。【
