1、紫外可见分光光度法UV VISUltraviolet visiblespectrophotometry 基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法 叫吸光光度法 包括 比色法 通过比较有色溶液颜色深浅分光光度法 根据物质对一定波长的光的吸收程度 依据物质对不同波长范围光的吸收主要有 特点灵敏度高 测定下限可达10 5 10 6mol L 1 10 4 10 5 准确度能够满足微量组分 1 的测定要求 Er 1 5 操作简便快速应用广泛 12 1概述 12 2光度分析方案的设计 12 3吸光光度法应用简介 12 1概述 12 1 1光的基本性质 12 1 2物质对光的选择性吸
2、收 12 1 3光吸收的基本定律 12 1 4分光光度法及其仪器 波动性 粒子性 E 光的折射 光的衍射 光的偏振 光的干涉 光电效应 光的波粒二象性 光的基本性质 光谱区间 射线 x射线 紫外光 红外光 微波 无线电波 10 2nm10nm102nm104nm0 1cm10cm103cm105cm 可见光 400 750nm 0 1nm 10nm 750nm 0 1cm 0 1mm 1m 1m 1000m 10nm 200nm 200 400nm 远紫外 近紫外 真空紫外 单色光 复合光 单色光 复合光 单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 互补色 1 吸收光与透射光 当复合光照射到物体
3、上时 一部分光被吸收 而另一部分光则被透射过去 即 入射光 吸收光 透射光 吸收光 透射光 互补 物质的颜色与光的关系 完全吸收 完全透过 吸收黄色光 光谱示意 光的作用方式 表观现象示意 复合光 不同颜色的可见光波长及其互补光 300 400 500 600 700 nm 545 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 Absorbance MnO4 的吸收光谱 定性分析基础 定量分析基础 物质对光的选择性吸收 在一定实验条件下 A c 1 透光率 透射比 Transmittance 透光率定义 T取值为0 0 100 0 全部吸收 T 0 0 全部透射 T 100 0 吸光度与光程的关系A
4、 Kbc 光源 检测器 显示器 参比 朗伯定律 1760 吸光度与浓度的关系A Kbc 比尔定律 1852 溶液浓度的测定 A bc 工作曲线法 校准曲线 朗伯 比尔定律的分析应用 01 02 03 04 0c mg mL A 0 800 600 400 200 00 Ax cx 分光光度法 通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光 波长可调 故选择性好 准确度高 仪器 可见分光光度计 仪器 紫外 可见分光光度计 光源 发出所需波长范围内的连续光谱 有足够的光强度 稳定 可见光区 钨灯 碘钨灯 320 2500nm 紫外区 氢灯 氘灯 180 375nm 氙灯 紫外 可见光区均可用作光源 一 分光光
5、度计的主要部件 单色器 将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置 棱镜 依据不同波长光通过棱镜时折射率不同 入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝 白光 红 紫 1 2 800600500400 光栅 在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕 600 1200 2400条 mm M1M2出射狭缝 光屏 透镜 平面透射光栅 光栅衍射示意图 原理 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光 波长范围宽 色散均匀 分辨性能好 使用方便 吸收池 比色皿 用于盛待测及参比溶液 可见光区 光学玻璃池 350 3200nm 紫外区 石英池玻璃 185 4000nm 检流计 指示器 低档仪器 刻度显示
6、中高档仪器 数字显示 自动扫描记录 检测器 利用光电效应 将光能转换成电流讯号 光电池 光电管 光电倍增管 吸光光度法仪器主要差异比较 二 分光光度计的类型 1 单光束分光光度计 2 双光束分光光度计 多通道仪器同时测量200 820nm范围内的整个光谱 比单个检测器快316倍 信噪比增加3161 2倍 3 其他类型分光光度计 纤维光度计将光度计放入样品中 原位测量 对环境和过程监测非常重要 0 575 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 单波长单光束分光光度计 简单 价廉 适于在给定波长处测量吸光度或透光度 一般不能作全波段光谱扫描 要求光源和检测器具有很高的稳定性 单波长双光束分光光度计
7、2 12 3吸光光度法应用简介 12 3 1微量组分的测定 12 3 2示差光度法 12 3 3络合物组成的测定 1 单一组分的测定 标准工作曲线法先配制一系列标准溶液 在最大吸收波长处 测出它们的吸光度 作图 同条件测未知液的吸光度 从图中查出未知液的浓度 标准工作曲线图 Ax cx 微量铁的测定 氨基酸的测定 邻二氮菲法 茚三酮法 紫色化合物 蛋白质的测定 考马斯亮蓝法 总磷的测定 海水中营养盐的测定 磷钼蓝法 单组分的测定 磷的测定 DNA中含P 9 2 RNA中含P 9 5 可得核酸量 H3PO4 12 NH4 2MoO4 21HNO3 NH4 3PO4 12MoO3 12NH4NO3
8、 12H2O 磷钼黄 小 磷钼 V 蓝 大 2 多组分的测定 根据加合性原则 解联立方程 可求得Cx Cy 为物质的特征参数 可通过配制标准溶液测得 由x y标液在 1 2处分别测得 x y组分不能直接测定 在 1处测组分x 在 2处测组分y b 在 1处测组分x 在 2处测总吸收 扣除x吸收 可求y 示差法 以浓度为Cs的标准溶液为参比 Cx Cs Ax 适宜高浓度的测定 标准溶液cs c1 c2 c3 以cs作参比 调A 0 测c1 c2 c3 的 A 用 A对 c作图 同条件下测 Ax 从差示工作曲线中查出 cx 示差法提高准确度的实质 常规法 Tx 50 100 落在测量误差较大的范围
9、 示差法 Tr Ts Ts 落在测量误差较小的范围 结论 示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度 标尺扩展10倍 络合物组成的测定 1 摩尔比法 饱和法 固定cM 改变cR从0开始增大 M nR MRn 在特定波长测定 CR CM 2 等摩尔连续变化法 Job CM C从0 1 n 1 CM C 0 5 n 2 CM C 0 33 目视比色法 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低 半定量 不可分辨多组分 方法简便 灵敏度高 1 了解分子对光的吸收 吸收曲线 定性分析的基础 2 掌握光吸收基本定律 朗伯 比尔定律 定量分析的基础A Kbc lgT式中各参数的物理意义 定量计算
10、3 分光光度计基本部件 4 灵敏度的表示 S5 显色反应及条件的确定 显色剂用量 酸度 时间 温度 干扰及消除 6 吸光测量条件的选择 波长 浓度 参比的选择7 应用及方法 单一组分测定示例 多组分测定 高浓度组分测定 络合物组成的测定 本章要求 1 取钢样1 00g 溶解 将其中锰氧化成高锰酸盐 准确配制成250mL 测得其A为1 00 10 3mol L 1KMnO4溶液A的1 5倍 计算钢样中锰的百分含量 锰的原子量为54 94 2 含铁约0 2 的试样 用邻二氮菲光度法 1 1 104 测定 试样溶解后稀释至100mL 用1 00cm比色皿 在508nm波长下测定A a 为使A测量引起的浓度相对误差最小 应当称取试样多少克 b 如果所用光度计吸光度最适宜范围为0 200至0 650 测定时应控制含铁的浓度范围为 铁的原子量为55 85
