1、步 骤革 兰 氏 染 色 法 一 般 包 括 初 染 、 媒 染 、 脱 色 、 复 染 等 四 个 步 骤 ， 具 体 操 作方 法 是 ： 1） 涂 片 固 定 。 2） 草 酸 铵 结 晶 紫 染 1 分 钟 。 3） 自 来 水 冲 洗 。 4） 加 碘 液 覆 盖 涂 面 染 约 1 分 钟 。 5） 水 洗 ， 用 吸 水 纸 吸 去 水 分 。 6） 加 95%酒 精 数 滴 ， 并 轻 轻 摇 动 进 行 脱 色 ， 20 秒 后 水 洗 ， 吸 去 水 分 。 7） 蕃 红 染 色 液 （ 稀 ） 染 2 分 钟 后 ， 自 来 水 冲 洗 。 干 燥 ， 镜 检 。 原 理
2、通 过 结 晶 紫 初 染 和 碘 液 媒 染 后 ， 在 细 胞 壁 内 形 成 了 不 溶 于 水 的 结 晶 紫 与碘 的 复 合 物 ， 革 兰 氏 阳 性 菌 由 于 其 细 胞 壁 较 厚 、 肽 聚 糖 网 层 次 较 多 且 交 联 致密 ， 故 遇 乙 醇 或 丙 酮 脱 色 处 理 时 ， 因 失 水 反 而 使 网 孔 缩 小 ， 再 加 上 它 不 含 类脂 ， 故 乙 醇 处 理 不 会 出 现 缝 隙 ， ， 因 此 能 把 结 晶 紫 与 碘 复 合 物 牢 牢 留 在 壁 内 ，使 其 仍 呈 紫 色 ； 而 革 兰 氏 阴 性 菌 因 其 细 胞 壁 薄 、
3、外 膜 层 类 脂 含 量 高 、 肽 聚 糖层 薄 且 交 联 度 差 ， 在 遇 脱 色 剂 后 ， 以 类 脂 为 主 的 外 膜 迅 速 溶 解 ， 薄 而 松 散 的肽 聚 糖 网 不 能 阻 挡 结 晶 紫 与 碘 复 合 物 的 溶 出 ， 因 此 通 过 乙 醇 脱 色 后 仍 呈 无 色 ，再 经 沙 黄 等 红 色 染 料 复 染 ， 就 使 革 兰 氏 阴 性 菌 呈 红 色 。 染 色 的 差 异 主 要 是 由 于 阴 性 与 阳 性 细 菌 细 胞 壁 的 差 异 所 应 起 的 。抗酸染色法 acidfast staining method 1882 年由埃利希（
4、FEhrlich ）首创并经 F齐尔（Ziehl）改进而创造出的细菌染色法。其中最具代表性的为对结核菌的齐尔-尼尔森（ZiehlNeelsen）染色法和齐尔- 加贝特（ZiehlGabbet）染色法。用石碳酸复红染色后，用盐酸乙醇分色，再用美蓝进行对比染色，即不再脱色而呈现石碳酸复红的红色。 抗 酸 染 色 的 原 理分 枝 杆 菌 的 细 胞 壁 内 含 有 大 量 的 脂 质 ， 主 要 是 分 枝 菌 酸 ， 它 包 围 在 肽 聚 糖 的 外 面 ，所 以 分 枝 杆 菌 一 般 不 易 着 色 ， 要 经 过 加 热 和 延 长 染 色 时 间 来 促 使 其 着 色 。 但 分 枝
5、 杆 菌 中的 分 枝 菌 酸 与 染 料 结 合 后 ， 就 很 难 被 酸 性 脱 色 剂 脱 色 ， 故 名 抗 酸 染 色 。 齐 -尼 氏 抗 酸 染 色 法 是 在 加 热 条 件 下 使 分 枝 菌 酸 与 石 炭 酸 复 红 牢 固 结 合 成 复 合 物 ，用 盐 酸 酒 精 处 理 也 不 脱 色 。 当 再 加 碱 性 美 兰 复 染 后 ， 分 枝 杆 菌 仍 然 为 红 色 ， 而 其 他 细 菌及 背 景 中 的 物 质 为 兰 色 。 抗 酸 染 色 一 般 步 骤1） 初 染用 玻 片 夹 夹 持 涂 片 标 本 ， 滴 加 石 炭 酸 复 红 2-3 滴 ， 在 火 焰 高 处 徐 徐 加 热 ， 切 勿 沸腾 ， 出 现 蒸 汽 即 暂 时 离 开 ， 若 染 液 蒸 发 减 少 ， 应 再 加 染 液 ， 以 免 干 涸 ， 加 热 3-5 分钟 ， 待 标 本 冷 却 后 用 水 冲 洗 。 2） 脱 色3%盐 酸 酒 精 脱 色 30 秒 1 分 钟 ； 用 水 冲 洗 。 3） 复 染用 碱 性 美 兰 溶 液 复 染 1 分 钟 ， 水 洗 ， 用 吸 水 纸 吸 干 后 用 油 镜 观 察 。
