1、项目三 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量一实训目的1 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作步骤2 学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS 能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成 SDS-
2、蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X10416.5X10 4 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。 LogMWK bm(LogMW 为分子量的对数，K、b 为常数，m 为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量.三、实训器材序号 设备名称 规格，型号 数量1 垂直板电泳槽及附件 12 直流稳压稳流电泳仪 可变压 13 微量进样器 24 玻璃注射器 15 玻璃平板 46 电炉 1序号 试剂 纯度、浓度
3、 作用 配制方法 需要工具 需要工具1 低分子量标准蛋白质样本2mg/ml 以标准样品为对照即可确定样品各区带的成分见表格下方水浴锅、小烧杯，玻璃棒2 样品 1020mg/ml 作为实验组来测定蛋白质的分子量同上 水浴锅、小烧杯，玻璃棒3 浓缩胶缓冲液 呈弱酸性，使甘氨酸解离很少，在电场作用下，涌动效率低，二氯离子含量高，形成较高的电位梯度压着蛋白质聚集在一起，凝缩为一狭小区带。同上 天平、容量瓶、棕色试剂瓶4 分离胶缓冲液 呈碱性，甘氨酸解离度大， 同上 天平、容量瓶、棕色涌动速率增加，紧随氯离子之后，在电场作用下，蛋白质根据其固有的电性得到分离。试剂瓶5 电极缓冲液 保证电泳的 PH，起传
4、播电流作用同上 1000ml 的容量瓶、天平6 过硫酸铵（AP） 1% 作为催化剂，产生自由基，加速凝胶聚合。同上 天平、容量瓶7 SDS 1% 去掉其电荷效应，使样品的蛋白质分子的迁移率完全取决于分子量同上 天平、100ml 容量瓶8 样品缓冲液 同上 天平、100ml 容量瓶9 样本变性液 使蛋白质变性，固定在凝胶上同上 天平、100ml 容量瓶10 固定液 使蛋白质固定在凝胶上，便于后续过程中色普带的确定同上 天平、100ml 容量瓶11 染色液 同上 天平、100ml 容量瓶12 脱色液 脱去凝胶上的染色液，使蛋白质谱带清晰同上 天平、100ml 容量瓶13 保存液 保存凝胶，便于下次
5、使用 同上 天平、100ml 容量瓶14 指示染料液 便于观察蛋白质在凝胶电泳中的位置，有利于调节电流同上 天平、100ml 容量瓶15 TEMED 加速剂，可催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺的聚合同上 天平、100ml 容量瓶配制方法1、浓缩胶缓冲液：1.5 克 Tris、12.0 毫升 1mol HCl，加水混匀定容至 25 毫升。2、分离胶缓冲液：18.15 克 Tris、48.0 毫升 1 mol HCl，加水混匀定容至 100 毫升。3、电极缓冲液：3 克 Tris，14.4 克甘氨酸、1 克 SDS，加水混匀定容至 1000 毫升。4、1过硫酸铵：1 克过硫酸铵溶于 l00
6、ml 蒸馏水中，临用前配制。5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B 液)1：7(v/v)稀释。6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2SDS， 10蔗糖，0.001溴酚兰)；0.8 克SDS， 4 克蔗糖溶于样本缓冲液定容至 20 毫升，再 1 滴 0.1溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。7、固定液：57.0 克 TCA，17.0 磺基水杨酸，150 毫升甲醇，加水 350 毫升混匀。或 25异丙醇和 10乙酸的混合液中 1h，蛋白质就得到固定了。8、染色液：1.25 克考马斯亮兰 R-250，227 毫升甲醇，22
7、7 毫升水，46 毫升冰乙酸混匀，滤纸过滤。9、脱色液：10乙醇-70醋酸。 100 毫升乙醇，70 毫升醋酸加水混匀定容至 1000 毫升。10、保存液：10乙醇-10醋酸 -10甘油，100 毫升乙醇， 100 毫升醋酸，100 毫升甘油加水混匀定容至 1000 毫升。11、指示染料液：0.1 溴酚兰(BPB)，100 毫克溴酚兰溶于 100 毫升水中。四、实训步骤（一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 电泳槽的安装：干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用 1.5的琼脂密封。2. 样品处理：将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度 2mg/ml），在沸水中加热
8、34min，待冷却后作点样用。3. 制胶：选择合适的胶浓度按下表配制 7.5的分离胶，（为小孔胶，进行电泳和分子筛分离）1、分离胶的制备：10（催化剂过硫酸铵，加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）试 剂 分离胶 （10）（单位：ml ）A 液 3C 液 1.85蒸馏水 3.51%TEMED 0.6E 0.05 总量 9ml，化学聚合 3060 分钟2、浓缩胶的制备：4.5为大孔胶，进行样品浓缩，试 剂 浓缩胶 （10）（单位：ml ）A 液 0.43C 液 1.25蒸馏水 0.91%TEMED 0.25E 0.015 总量 2.845ml，光聚合 3060 分钟（催化剂核黄素，加
9、速剂（ TENED）混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘 3cm 处，立即覆盖 23mm 水层，静止聚合约 40min 左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分，将配制好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。4. 点样：用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液 5l，按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液 25l，注入其它样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。5. 电泳：加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为 15mA，当指示剂进入分离胶
10、后，电流需加大到 30mA，电压恒定在 80100 伏之间，约 34h 后，指示剂达到距前沿 12cm 时，可终止电泳。6. 固定：胶取出后，在水中浸泡 10min，浸出部分 SDS，然后将胶浸泡在 25异丙醇和 10乙酸的混合液中 1h，蛋白质就得到固定了。7. 染色：取出凝胶板，测定胶长（D1 ）后，加入染色液染色 2h。8. 脱色将胶放在脱色液中脱色 0.5h，每隔 0.5h 换一次脱色液，至少换 3 次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶长（D2）。（二）、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和
11、各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为 d1，蛋白质迁移距离定为 d2，并以 D1 定为凝胶染色前的长度，D2定为凝胶染色后的长度。根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率 Rm：Rm d2d1×D1D2 以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。五、实训结果分离胶未凝固六、实训结果分析1、加入催化剂过硫酸铵的量或浓度不够，导致分离胶的聚合时间过长，可适当加大过硫酸铵的量或增大过硫酸铵的浓度，2、操作的室温温度过低，延长聚合时间，必要时可用电炉在电泳槽旁加热，缩短聚合时间3、过硫酸铵过期，起不到催化作用4、垂直玻璃板的底部应与底部橡胶边缘紧密结合，避免分离胶凝固就漏胶。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱
