1、原位杂交1 探针的设计与合成1) 根据实验室已有的 p8 基因 cDNA 全长序列，用 premier primer5.0 设计引物 p81 和p82，以卤虫 cDNA 为模板，PCR 扩增得到 346bp 的产物，用 Takara 胶回收试剂盒回收纯化。引物编号 引物序列 长度p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bpp82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp2) 目的片段克隆a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在 1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：目的 PCR 片段 5
2、 lpGM-T 载体（约 50ng/uL） 1 l10×T4 DNA Ligation Buffer 1 lT4 DNA Ligase（3U/uL） 1 l无菌去离子水 3 l总体积 10 lb. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于 PCR 仪中 16过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入 16 l 的 IPTG（50mg/ml） 、40 l 的 X-gal（20mg/ml ） ，使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于 37培养箱 1-3 小时，使溶解 X-gal 的二甲基甲酰挥发干净。d. 将 10 l 的连接产物加到 1
3、00 l DH5感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于 42水浴 90 秒，取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入 500 l 37预热的 LB（不含抗生素）培养基，150rpm 摇床 37振荡培养 45 分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于 4000g 下离心 10 分钟，去掉上清，加入 100 l 培养液重溶并加入到配制好的 LB 固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37培养 12-16 小时。e. 挑取白色菌落直接进行 PCR 检测，筛选转化子。f. 将转化子接种于 LB
4、 液体培养基中培养 24 小时，吸取 1mL 菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。3) 重组质粒的线性化取 6 l 以测序的重组质粒，选取 NcoI 内切酶 37酶切 4h。酶切反应体系为 20 l：质粒 6 l10xK Buffer 2 lNcoI 酶 1 l0.1% BSA 2 l灭菌水 9 l终体积 20 l取酶切前后的质粒各 4 l，经 1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用 Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。4) 探针合成按罗氏 DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义 RNA 探针。使用的所有试剂和器皿均经去 R
5、Nase 处理，合成方法如下 :先准备反应体系。冰上向RNase-Free 的微离心管中顺序加入下列试剂:纯化的线形质粒 1 gRnase-free dH2O up to 13 l10xNTP labeling mixture 2 l10xTranscription buffer 2 lRnase inhibitor 1 lSP6 RNA Polymerase 2 l总体积 20 l稍混匀，短暂离心将反应液集于管底，37 2 h。反应结束后再补加 2 l DNase I，37 15 min，反应结束后加入 0.2M EDTA 2 l 终止反应。取 3-5 l 反应产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
6、-20保存备用。2. 石蜡切片的制备本实验在杂交结束前均必须保证 RNase-free.玻璃器皿采用 180烘烤 10 小时。其它采用DEPC 处理，高温灭菌锅高温降解 DEPC。若仪器不能高温处理，可用 3%的 H2O2 处理半小时以上，DEPC 水冲洗干净，烘干。1) 组织的固定与包埋选取不同发育时期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的卤虫，经 DEPC 处理水冲洗表面盐分后，加入新鲜配制的 4%多聚甲醛，于 4固定 5-8 h，再分别按下列顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水 1 h，50%乙醇脱水 1 h，70%乙醇脱水 1 h，80%乙醇脱水乙醇脱
7、水 1 h，90%乙醇脱水 1 h，无水乙醇脱水 1 h，无水乙醇脱水 1 h，无水乙醇:二甲苯(1:l)透明 10 min，二甲苯透明 10 min、二甲苯:54石蜡(1:1)浸蜡 30 min，54石蜡浸蜡 1 h，54石蜡包埋。2) 组织切片：将包埋的组织按 7 m 的厚度切片，在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加DEPC 处理水，组织片于 42展片台上展片 1 小时，再置于 40恒温箱中烘片 12 小时后放于 4密封保存备用。3. 杂交前处理切片经二甲苯脱蜡 2×15 min，无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30% 乙醇脱水各 5 min，
8、后 DEPC 处理水 2×5 min，然后进行杂交前切片处理，具体步骤如下:1) lxPBS(pH7.4)室温孵育 2x5 min。2) 0.3%TtitonX-100 的 PBS 中去膜处理 15 min。3) lxPBS 洗涤 2x5 min。4) 无 RNase 的蛋白酶 K(20 g/mL)37消化 30 min。5) 100mMGly/PBS 中洗 2x5 min。6) lxPBS 洗涤 2x5 min。7) 4%多聚甲醛(4) 固定 5min。8) lxPBS 洗涤 2x5 min。9) 含有 0.25%(W/v)的乙酸酐的 100mM 的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电
9、荷处理 15 min(现配现用)。10) lxPBS 洗涤 2x5 min。4.预杂交和杂交1) 滴加预杂交液于载玻片上，然后置于湿盒中，50预杂交 2 小时。2) 弃去预杂交液，立即滴加杂交液，置于湿盒中 52杂交过夜。5.杂交后处理杂交完，以后的步骤不必要特意防 RNA 酶。1) 弃去杂交液，载片浸入 2xSSC 中 2x15 min。2) 载片浸入 1xSSC 中 55水浴摇动 2x15 min。3) 用含 20g/mL 的 RNaseA 的 NTE 缓冲液 37消化 30 分钟，以去除未结合的探针。4) 载片浸入 0.5xSSC 中 55水浴摇动 2x15 min。5) 载片浸入 0.5xSSC 中室温 10 min。6. 抗体反应1) 用 washing buffer 清洗组织片 5 min。2) 滴加封闭液缓冲液室温下处理组织片 30 min。3) 用抗体液覆盖封闭后的组织片，置于湿盒中孵育 3h 以上。4) Washing buffer 洗 2x15 min。5) Detection buffer 中平衡 2-5 min。7. 显色：加入显色液于湿盒中黑暗静止显色 16h8. 封片与观察：1) 显色合适时，用 TE buffer 终止着色反应，再用蒸馏水清洗。2) 滴加封片剂封片，显微镜下观察和摄影。
