1、实验六抗菌药物敏感性试验AntimicrobialSensitivityTest 可预测抗菌药物治疗的效果 敏感 治疗可能有效 耐药 可能失败 指导临床医生合理选择抗生素 AST的结果为 耐药 则应更换药物 提供所选择药物的依据 监测耐药性 分析耐药菌变迁 掌握耐药菌感染病流行病学 控制和预防耐药菌感染发生和流行 意义 药敏试验常用方法 1 纸片扩散法 DiskDiffusionTest Kirby Bauer法 K B纸片琼脂扩散法 和直接纸片药敏法2 稀释法 DilutionTest 琼脂稀释法和肉汤稀释法3 抗生素浓度梯度法 E试验 E test 一 纸片扩散法 一 试验原理将含有定量抗
2、菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上 纸片中所含的药物吸收琼脂中水分 溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度 在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度 并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系 即抑菌圈愈大 MIC值愈小 二 培养基和抗菌药物纸片 1 抗菌药物纸片选择直径为6 35mm 吸水量为20 l的专用药敏纸片 用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求 含药纸片密封贮存于2 8 且不超过1周 2 培养基水解酪蛋白 M H 培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基 4 保存 1 用接种环分别在琼脂平
3、板上挑取形态相似的大肠杆菌菌落4 5个 接种于3 5mL肉汤管中2 35 温箱培养2 8h 与标准比浊管比较 若菌液浓度太浓时 可用肉汤或生理盐水稀释至与0 5麦氏标准比浊管浊度相同3 在15min内 用无菌棉签蘸取菌液 并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M H琼脂平板上 注意 涂布要均匀 致密 待干 三 试验步骤 4 用镊子蘸取95 乙醇并通过火焰 待烧干后再蘸取乙醇重复上述操作 共三次即可达到灭菌的效果 待冷却后 用此无菌镊子夹取不同药敏纸片 按一定间隔贴在平板的不同区域 即两纸片间距不小于24mm 纸片距平板边缘不小于15mm 5 35 温箱培养18 24h观察结果 四 结果判断和报告用精
4、确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径 根据NCCLS标准 作出 敏感 耐药 和 中介 的判断 几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度 五 药物敏感试验结果解释 敏感 susceptible S 表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制 耐药 resistant R 表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制 临床治疗无效 中介 intermediate I 表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株 使用高于正常给药量有疗效 六 质量控制 采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做药敏试验目的 检查试验条件 如培养基 含药纸片和接种菌量
5、 和操作技术等是否合格质控标准菌株 大肠杆菌ATCC25922 粪肠球菌ATCC29212 金黄色葡萄球菌ATCC25923等 二 稀释法 琼脂稀释法 将药物混匀于琼脂培养基中 配制含不同浓度药物平板 使用多头接种器接种细菌 经孵育后观察细菌生长情况 以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC MIC 稀释法所测得的某抗菌药物能抑制被检菌肉眼可见生长的最低浓度 琼脂稀释法具体实验步骤 1 抗菌药物储备液的配制 将各种抗菌药物制备成琼脂稀释法试验需要的药物浓度 2 含药琼脂培养皿的制备 将灭菌熔化的M H琼脂在水浴中平衡至48 50 培养皿置超净台上 将稀释好的中间浓度的抗菌药物溶液2mL与
6、18mLM H琼脂混匀 立即倒入培养皿中 培养基厚度约4mm 待培养基冷却并使琼脂表面的水份蒸发干后备用 3 接种 将试验菌株在普通琼脂上划线培养 挑取4 5个形态特征一致的菌落接种于无菌M H肉汤中培养8h 用生理盐水调节菌液浓度使其为0 5麦氏标准管浊度 1 108CFU mL 然后再用生理盐水稀释10倍 在15min内用定量接种器吸取1 2 L接种于制备好的M H琼脂表面 并做好标记 标明接种点的位置 首先接种无药对照平皿 随后从最低药物浓度开始依次接种不同浓度的药物平皿 接种后的平皿在室温下静置 待接种点水份被琼脂吸收再将平皿反转 于37 培养18 24h 4 结果判读 首先检查不含抗
7、菌药物的对照组平板 必须每一菌株都有生长 平板放在黑色不反光的表面上观察 记录能完全抑制细菌生长的抗菌药物的最低抑菌浓度 磺胺可见少许散在细菌生长 生长稀少或仅有一两个菌落的可忽略不计 如果低浓度药物平皿无菌 高浓度药物平皿却有细菌生长 应重复试验 检查待测细菌的纯度 5 质量控制 每个琼脂平板应同时接种标准菌株 如大肠杆菌ATCC25922 作为质控菌 一 常量稀释法实验步骤 1 取无菌小试管10支排于试管架 于第一管加入MH肉汤1 9ml 2 10管各加1ml 2 于第一管加入稀释好的2560 g mL的药物原液0 1ml 混匀后取1ml加入第2管 依次对倍稀释 自第9管吸出1ml弃去 第
8、10管为对照管 各管中的药物终浓度为128 64 32 16 8 4 2 1 0 5 g mL 二 稀释法 肉汤稀释法 3 另设测试菌生长对照管一支不含药物 将已调节好的待测菌悬液0 1mL加入各含药管内 使每mL含细菌约5 105CFU mL 4 各试管置37 孵育16 24h后观察结果 5 质控菌对照按上述操作平行进行 药物储备液 菌液的制备 结果判断同琼脂稀释法 二 微量稀释法实验步骤 1 将纯化的细菌接种肉汤 置37 培养箱中培养16 24h 2 按照测定的CFU值将菌液稀释到107CFU ml3 在微量平板1 12孔加无菌肉汤100 l 4 第1孔中加100 l药物原液2560 g
9、ml倍比稀释到10孔 第10孔稀释好后吸100 l弃去 5 11孔为不加菌液对照 12孔为不加药物对照6 在1 10孔 12孔中各孔加5 l107CFU ml的菌液7 在微量振荡器上振荡 37 培养箱中培养24 48h8 观察结果 培养后24h记录MIC 培养后48h记录MBC注意 每种药物作两个重复 倍比稀释 123456789101112 三 E试验 一 原理E试条是一条5mm 50mm的无孔试剂载体 一面固定有预先制备的 浓度呈连续指数增长稀释抗生素 另一面有读数和判别的刻度 将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上 经孵育过夜 围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈 圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗
10、生素抑制细菌的最低浓度 二 细菌接种和加样使用厚度为4mmM H琼脂平板 用0 5麦氏浓度的对数期菌液涂布 待琼脂平板完全干燥 用E试验加样器将试条放在已接种细菌的平板表面 试条全长应与琼脂平板紧密接触 试条MIC刻度面朝上 浓度最大处靠平板边缘 三 结果判断和报告读取椭圆形抑菌圈与E试验试条的交界点值 即为MIC值 三种方法的比较 纸片扩散法稀释法E Test 优点缺点 操作简单 重复性好 成本较低 无需特殊设备 灵活选择抗菌药物 结果容易理解 标准化方法 结果可靠 检测菌的范围更广 定量检测 更好地反映菌株耐药程度 操作简单 定量检测 不适用于生长较慢或生长速率不同的菌株以及某些苛养菌 操作费时费力 成本太高 常规试验很难应用 局限性 主要用于苛养菌或厌氧菌 主要参考文献 1 倪语星 王金良 徐英春 抗微生物药物敏感性试验规范 上海科学技术出版社 2002 2 管远志 王艾琳 李坚 医学微生物学实验技术 化学工业出版社 2006
