1、PCR 产物的克隆 PCR 产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的 PCR 产物直接进行连接。载体可用 EcoR V 或 Sma I 切成平头；PCR 产物纯化后，可以在 22用 DNA 聚合酶 I 作用 30min（利用该酶所具有的 35外切酶活性和 53的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR 产物也可不加处理。如果使用 Stratagene 公司的 pfu DNA 聚合酶或 New England Biolabs 公司的Vent DNA 聚合酶，这两种酶有 53校对能力，扩增出来的 PCR 产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易
2、见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入 PEG 8000，也只能很有限地提高效率。粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和 PCR 产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的 5端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分 PCR 产物 3端带有一个凸出的 dAMP 的特性，构建 3端带有凸出的 dTMP 的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在 70或 72下在只加入一种dNTP、即 dTTP 的反应体系中用 Taq DNA 聚合酶处理半小
3、时（也有人报道处理 12 小时能提高克隆效率，这样加 T 反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加 T 反应。载体自连、PCR 产物串连可以忽略。如果使用 ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加 T/A 法克隆，比平头连接效率高 50100 倍。一、PCR 产物的 TA 克隆 1. TA 克隆构建原理：TA 克隆系统由 Invitrogen 公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于 PCR 产物的克隆和测序。其原理是利用 Taq酶能够在 PCR 产物的 3末端加上一个非模板依赖的 A，而 T 载体是一种带有 3T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地
4、把 PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。2.操作步骤 连接反应一般在灭菌的 0.5ml 离心管中进行。 10l 体积反应体系如下：取 T 载体 1l (50ng)，加入等摩尔数 PCR 产物 。加入含 ATP 的 10×Buffer 1l，T4 DNA 连接酶合适单位，用 ddH2O 补足至 10l 。 稍加离心，通常为 14-16水浴连接 8-14hr，或 4过夜。 转染，蓝白斑筛选同前。二、注意事项1.要获得目的基因的 TA 克隆，PCR 产物的特异性要好。2.PCR 产物在 TA 克隆前要通过纯化。3.在 PCR 产物回收、纯化过程中防止外来 DNA 污染。
