1、第23讲,流式细胞仪检测技术（FCM）,EPICS XL 流式细胞分析仪,FC500,Dual Parameter Histograms,细胞组学研究的过去、现在和未来,暗视野光镜，相差显微镜，微分干涉对比显微镜，偏振光显微镜，荧光显微镜,单光子共聚焦显微镜，多光子共聚焦显微镜,大体荧光成像系统,细胞计数仪,18世纪，明视野显微镜发明,流式细胞仪,分光高度计，荧光高度计，干涉光高度计,放射自显影,细胞成像定量分析系统,?,目标细胞分选,流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特
2、定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞仪的特点,单个细胞/生物颗粒分析同时多参数、多荧光分析高通量检测/高速度 10000个细胞/秒以上定性/定量分析分选特定性状或功能的细胞可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液,目前流式细胞仪可以检测的类别,细菌,浮游生物,DM：0.2m 15m,单核细胞,中性粒细胞,淋巴细胞,红细胞,流式细胞仪的基本构造,激光发射器发出所需要的波长的激光,前向散射光检测器,侧向散射光检测器,光学滤镜
3、,流动室与液流系统：将细胞单个压入流动室,信号收集与数据处理系统,光源与光学系统,流动室,分选,将目标细胞分离并富集，进行后续研究。分选纯度99%,FSC和SSC,直方图,流式细胞仪显示图的种类,把前向散射光图和侧向散射光图的一维图像在二维图像上投影，便是我们平常所看到的流式图。所以横坐标表示的是细胞的直径大小；纵坐标表示的是细胞的复杂程度。两者相结合就能说明细胞种类,散点图,二维等高图和密度图,假三维图与三维图,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488
4、620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670 免疫荧光 红TO 488 525 RNA染色 绿,样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋,单细胞 悬液,标记荧光抗体,检测,表型测定,细胞分选,流式细胞术操作流程,统计学 分析,继续培养,FCM的检测范围,细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体,FCM的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴
5、瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,FCM的科研应用,树突细胞研究干细胞研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术与分子生物学研究,FCM的应用肿瘤学,细胞周期分析细胞凋亡的分析凋亡细胞的分析凋亡相关蛋白的分析肿瘤相关基因表达的研究多药耐药基因的研究,细胞周期分析,DNA分析的临床意义,DNA分析诊断肿瘤DNA非整倍体细胞峰突出的四倍体细胞峰SPF15% DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿
6、瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性,正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT),多发性骨髓瘤,FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用,DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,细胞凋亡分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检测Ladders实验流式细胞术检测与凋亡相关的病理过程HIV自
7、身免疫性疾病肿瘤,细胞凋亡分析,细胞凋亡的主要指标细胞内酶改变：Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：FasBcl-2,细胞凋亡PI分析,细胞凋亡Active Caspases-3,细胞凋亡Caspases-3,细胞凋亡Annexin V,细胞凋亡Annexin V,细胞凋亡BrdU,FCM的应用免疫学,淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析CD4绝对计数HIV的诊断与研究淋巴细胞 CD4/CD8分析CD4绝对计数T细胞活化细胞移植的交叉
8、配型和免疫状态监测,FCM的免疫学应用,免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化细胞因子的研究淋巴细胞的增殖树突状细胞的研究HLA-B27检测,淋巴细胞亚群分析,使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数,临床意义,了解在不同情况下体内免疫功能状态辅助临床疾病的诊断探索疾病的发病机理、病程、预后监测、指导临床治疗方案免疫系统疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测肿瘤病人化疗后免疫力检测,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,
