1、精品文档免疫组化方法（冰冻切片）A. 所需溶液和试剂1. 二甲苯2. 无水乙醇（ 100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）3. 苏木精（可选）4. 固定剂： 请参考产品说明书选取合适的固定剂。a.b.c.d.10%中性福尔马林丙酮甲醇3%甲醛溶液： 配制时，将18.75 ml 16% 甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。5.10X Tris 缓冲盐水（ 10X TBS）：在 800 ml 蒸馏水中加入 24.2 g 三羟甲基氨基甲烷 （Trizma base ，C H NO）和 80 g 氯化钠（ NaCl）。用浓盐酸将 pH 调节到 7.6 。41136.漂洗（缓冲）液：
2、1 X Tris缓冲盐水（ TBS）。 100 ml 10 X TBS 加 900 ml 水至 1L。7.甲醇 / 过氧化氢： 配制时，将10 ml 30% H 202 加入到90 ml 甲醇中。保存在 -20 C。8.封闭液： 1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。9.配制时，将 500 l 山羊血清和 30 l Triton-X 100加入到 9.5 ml 1X TBS 中。10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统 * 。11.DAB试剂或合适的底物： 按产品说明配制。B. 切片1. 对于保存在 -80 C 的样品： 切片前先从冰箱中取出放在
3、-20 C平衡 15 分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。2. 将样品切成大约 6-8 m厚，铺在带正电性的玻片上。3. 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片）C. 固定注意： 参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂1. 玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。a.b.c.d.10%中性福尔马林：室温 10 分钟。立即进行染色操作。冰丙酮： -20 C 10 分钟。风干。立即进行染色操作。甲醇： -20 C 10 分钟。立即进行染色操作。3%甲醛溶液： 室温 15 分钟。立即进行染色操作。1欢迎下载精品文档e. 3%甲醛 / 甲醇： 先在室温下 3%甲
4、醛中固定 15 分钟，然后在 -20 C 的甲醇中固定 5 分钟（ 中间不漂洗 ）。立即进行染色操作。D. 染色1.切片用漂洗液洗两次，每次5 分钟。2.室温下，浸泡在 3% H2 02/ 甲醇中孵育10 分钟3.用漂洗液洗两次，每次 5分钟。4.在切片上滴加封闭液，室温封闭1 小时。5.按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。6.去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 l 稀释的一抗。 4C 孵育过夜。7.去掉抗体。用漂洗液洗 3次，每次 5分钟。8.根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。9.用漂洗液洗 3 次，每次 5分钟。10.11.12.13.14.加入 100 400 l DAB 或合适的底物，近距离检测染色进展。一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。切片用蒸馏水洗两次，每次5 分钟。切片脱水：a. 在 95%乙醇中孵育两次，每次10 秒。b.c.在 100%乙醇中孵育两次，每次10 秒。在二甲苯中孵育两次，每次10 秒。15.加上盖玻片。2欢迎下载精品文档欢迎您的下载，资料仅供参考！致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书， 学习资料等等打造全网一站式需求。3欢迎下载
