1、第四章 微生物的生长与环境条件,第一节 纯培养微生物群体的生长,对于高等动植物而言，生长和繁殖是两个容易区分的概念；但对于微生物特别是单细胞而言，生长和繁殖很难区分。,生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加,生长,指生物个体数目的增加,繁殖,在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物生长的指标。,群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程,一、微生物纯培养的获得,平皿划线分离法,稀释平皿分离法,单孢子或单细胞挑取法,利用选择性培养基分离法,（一）、稀释分离法,（二）、选择性培养基
2、的利用,1.平皿划线分离法,用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,2.稀释平皿法,3.单孢子或单细胞分离法,采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。,在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。,（二）选择性培养基分离法,各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生
3、物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。,微生物纯培养分离方法的比较,二、 微生物生长的测定,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,微生物生长,微生物生长测量方法,细胞总数的测定,重 量 法,生理指标法,细胞数量的测定,细胞生物量的测定,DNA含量测定法,ATP含量测定法,活菌数量测法,比浊法,直接计数法,稀释平皿法,最大概率法,浓缩(滤膜)法,1.个体计数法,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数
4、； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,A.直接法,Direct Measurements of Microbial Growth,4X4,t,B 比浊法 这是测定悬液中细胞总数的快速方法 细胞数目越大，浊度越大，在一定浓度范围 内，细胞浓度同光密度成正比，与透光度成 反比。,2 活菌数量的测定,A 稀释平皿测数法 在理论上可以认为高度稀释的条件下，微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，每个活的单细胞能形成一个菌落。 具体方法同稀释平皿分离法一样。 计菌落数目: 按常规方法选择30300个菌落平皿进行计算 。（霉菌选择菌落数在10150之间的平皿进行计数 ）。,b.简接法,
5、原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。,稀释平皿测数法,计数和报告,到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。,1、菌落的选择,（1）单个菌做一个菌落计 （2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。 （3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,2、平板菌落计数的选择,选取菌落数在30300之间的平板。 （1）、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内： 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘
6、以相应的稀释倍数，做为每克（毫升）的菌落总数结果。,2、平板菌落计数的选择,2）若有两个连续稀释度的平板菌落在适宜范围： N=C/(n1+0.1n2)d 式中， N 样品中菌落数 C平板菌落数之和 n1第一个适宜稀释度平板数 n2第二个适宜稀释度平板数 d稀释因子（第一稀释度）,例：,N=C/(n1+0.1n2)d （2322443335）/2+(0.12) 10-2 544/2.2 10-2 24772=25000,3）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告 4）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告 5）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在303
7、00之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告 6）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。,若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如实例2）。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如实例3）。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数,3、菌落数的报告,1）菌落数在1100时，按实际数字报告； 2）如大于或等于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算； 3）所有平板蔓延菌落无法计数，报告菌落蔓延； 4）所有空白对照菌落生长，则检测结果无效； 5）固体检样以克（g)为单位报告， 6）
8、液体检样以毫升（ml）为单位报告， 7）表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。,B最大概率法,将待测样品在定量培养液中作一系列稀释培养。在一定稀释度前培养液出现细菌生长，而在这个稀释度以后，培养液中不出现细菌生长，将最后三级有菌生长的稀释度称为临界级数，从重复的三个临界级数求得最大概率数，可以计算出单位体积中细菌数近似值。,C 浓缩(滤膜)法,将待测样品通过滤膜富集，再与膜一起培养，最后可根据菌落数计算出样品含菌数。,（二）细菌生物量的测定,2 DNA含量测定法 间接推算微生物群体的生物量。核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.410-5ng.,测定细胞干重法
9、 将单位体积的液体培养基中培养的微生物，过滤或离心， 高温干燥，即可求得培养物的总生物量,3 ATP 含量测定法 微生物细胞中度含有相对恒定的ATP，而ATP与生物量之间 有一定的比例关系。,4 代谢活性法 通过测定活细胞代谢强度来估算其生物量，如 测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物质或氧气量。,（一）、细菌的生长曲线,（一）微生物典型的生长曲线,在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,生长曲线,三、微生物的群体生长规律,生长曲线可分：,延滞期,
10、对数期,衰亡期,稳定期,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。,迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃,通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短； 利用对数生长期的细胞作为“种子”； 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； 适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。,在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期：,延缓期出现的原因,2.对数期,对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短
11、，提高经济效益。,以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，,细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。,细菌研究中常用的三个参数,繁殖代数（n） 指数生长方式： 1 2 4 8 2n 设接种时细胞数为N0, 花费时间t后，繁殖n代，细胞数为Nt，它们之间的相互关系为： Nt = N0 X2n 以对数表示： Nt = N0 + n2 Nt - N0 n = = 3.32( Nt - N0 ) 2,3.稳定期,由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量)，结束对数生长期，进入稳定生长期。,原因：,获得
12、更多的菌体物质或代谢产物采取措施：,补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等,4.衰亡期,细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。,该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。,现象：,特点：,（二）、细菌生长的连续培养,分批培养：微生物置于一定容积培养基中，经培养一段时间，一次性收获 连续培养(continous culture of microorganisms)是
13、在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物,连续培养类型,恒浊连续培养,恒化连续培养,1、恒化连续培养,在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。,生长速率的限制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质,恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。,(二)恒浊连续培养,通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生
14、长连续进行的一种培养方式。,用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,连续发酵与单批发酵相比,优点：缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,（三）、同步培养,1.概念,同步培养(synchronous culture)：是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。,同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式,同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。,同步培养方法,机械方法,调整生理调节诱导,离心方法,过滤分离法,硝酸纤维素滤膜法,温度,培养基成份控制,光照和黑暗交替培养,硝酸纤维素滤膜法,离心法,谢谢,
