1、5期 高世强等:DNA微阵列技术在病原细菌基因转录谱分析中的应用1345DNA微阵列技术在病原细菌基因转录谱分析中的应用高世强,张新建,吴茂森,何晨阳(中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100094)摘要:DNA微阵列技术是近年来发展起来的一种功能基因组学研究技术。随着这项新技术的建立和日趋完善及其在植物病理学研究中的应用,为病原细菌致病机理的研究带来了新思路并开辟了新途径。利用DNA微阵列技术,检测病原细菌在不同生长条件下和在侵染植物过程中的基因转录谱,可以从基因组水平上鉴定出新的与毒性和适应性相关的基因及其表达调控网络,有助于阐明这些基因的生物学功能及其机
2、理。本文结合本实验室近几年来的相关研究结果,综述DNA微阵列技术在病原细菌转录谱研究中应用的最新进展。关键词:DNA微阵列;植物病原细菌;基因表达谱;病原物寄主互作;致病机制DNA Microarray Technology and Its Application in Transcriptional Profiling of Bacterial PathogensGAO Shi-qiang, ZHANG Xin-jian, WU Mao-sen, HE Chen-yang(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insec
3、t Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094)Abstract: DNA microarray technique is one of the most powerful and innovative technologies for functional genomic researches. With the increasing development and application in plant pathology, the techn
4、ique provides us the innovative idea and new insights into the pathogenic mechanisms of bacterial pathogens. Transcriptional profiling of the pathogens under in vitro and in vivo growth conditions revealed by DNA microarray analysis resulted in the identification of virulence- and adaptation-related
5、 genes and their regulatory networks, which is valuable to elucidate the biological functions of differentially-expressed genes. This paper has reviewed the latest progress in application of DNA microarray technology in the transcriptional profiling of pathogenic bacteria in combination with the rel
6、ated researches in authors laboratory in the past years.Key words: DNA microarray; Bacterial pathogens; Gene expression profiling; Pathogen-host interactions; Pathogenic mechanisms 0 引言DNA微阵列技术(DNA microarray technology)是近年来发展起来的基因组整体研究技术之一,目前己广泛应用于基因表达水平检测和多态性分析等方面。在细菌基因组序列已知的前提下,可将其全部基因同时呈现在一张片基上,
7、形成所谓的全基因组微阵列。病原细菌全基因组微阵列目前主要用于基因转录谱(transcriptional profile)分析和比较基因组学研究1。基因转录谱研究能在全基因组水平上对基因转录水平进行分析,快速给出在特定条件下细菌基因转录的全局模式。近年来愈来愈多细菌基因组序列信息的获得为研究寄主病原物互作机理提供了大量的非常有用的信息和数据2。阐明这些基因的功能是后基因组时代所面临的重大挑战,DNA微阵列表达谱技术正是细菌功能基因组学研究的主要手段之一。应用DNA微阵列技术进行植物病原细菌表达谱的研究也越来越多。本文结合本实验室近年来的相关研究结果,综述DNA微阵列技术在细菌基因表达谱方面的研究
8、进展,着重介绍植物病原细菌DNA微阵列表达谱技术及其应用。1 DNA微阵列制备与试验设计1.1 DNA微阵列种类DNA微阵列是将DNA序列有序地固化于支持物(玻片、硅片、尼龙膜等载体)表面,组成密集的二维分子排列,然后与已标记的靶分子杂交,通过检测杂交信号强度来判断样品中靶分子的数量。DNA微阵列按所点DNA的种类不同可分为两种:寡核苷酸微阵列和cDNA微阵列。寡核苷酸微阵列密集程度高,一致性和可重复性好,但费用高、灵活性差,主要用于DNA序列测定、SNP分析等,也可用于表达谱研究3。cDNA微阵列对靶基因检测的特异性好,技术相对简单、灵活性高,但重复性稍差,主要用于表达谱研究。1.2 DNA
9、微阵列制备寡核苷酸微阵列一般是在片基上原位合成寡核苷酸片段进行制备。cDNA微阵列是预先制备cDNA或基因组DNA的PCR产物,然后点制到片基上。由于具有很高的灵活性,且花费较低,实验室多自制cDNA微阵列进行研究,在此着重对cDNA微阵列的制备加以介绍。对于基因组序列已知的生物,可以直接根据序列设计全基因组微阵列。用Array Designer等软件设计引物,在合成DNA片段前用序列同源性搜索软件分析,保证扩增片段不与基因组其它序列杂交,通过PCR可以扩增获得代表每个ORF的DNA片段,经纯化后可以点到玻片上。笔者用这种方法制备了水稻白叶枯病菌低覆盖度的DNA微阵列。对于基因组序列未知的生物
10、,可以用DNA文库制备微阵列。Hayward等随机挑选了Plasmodium falciparum基因文库的3 648个克隆制成微阵列,鉴定了从营养体阶段向配子母细胞形成阶段转变过程中50多个表达明显变化的基因4,用该方法鉴定出的目的片段需要进一步进行测序分析。1.3 DNA微阵列技术试验设计由于DNA微阵列试验花费昂贵,在进行试验时需严格设计和认真操作。试验的严格设计可以提高数据可靠性。探针筛选、微阵列布局、生物学重复次数对试验数据质量都有影响。双色荧光试验是利用标记了绿色荧光Cy3和红色荧光Cy5的两个样品同时与微阵列进行杂交,微阵列上每一个点包括了这两种样品中相应mRNA的荧光信息,通过
11、比较二者的荧光信号强度计算相对表达量。因此,其试验设计和常规比较试验思路是一致的。最重要的是确定哪一个样品用哪一种荧光标记,哪两个样品要同时进行杂交分析。Yang等对此进行了详细的综述5。DNA微阵列试验在实际操作中至少应有3个重复。不必对同一个样品进行重复杂交分析,但是必须要进行试验重复。在细菌DNA微阵列点制时要用组成型表达的持家基因(house-keeping genes)作为正对照、用与所研究细菌ORF没有同源性的其它基因作为负对照、用点样液作为空白对照6。笔者在制备水稻白叶枯病菌DNA微阵列时,用病菌16S和23S作为正对照,用水稻actin基因和线虫ITS序列作为负对照,用点样液作
12、为空白对照。据此,可以对微阵列的制备等进行严格的质量控制7。2 DNA微阵列数据分析与诠释DNA微阵列分析产生了海量的数据,需要专业统计学家和专业软件对整体表达情况进行分析。遗传学分析的瓶颈也从试验层次转到了对数据结果分析的速度上。在进行数据分析以前,首先要对数据归一化,使得数据之间具有可比性。数据归一化需要通过微阵列上持家基因的信号强度作为标准,而且持家基因必须是在试验进行的不同条件下恒定表达8。由于细菌mRNA没有polyA尾,难以从总RNA中分离出mRNA进行下一步操作,因此可采用总RNA进行反转录标记及杂交分析,反转录标记总RNA时可采用16S和23S基因作为阳性对照进行标准化。另外,
13、微阵列扫描所得的数据是呈偏态分布的,需要先进行对数转换再进行分析。通过聚类分析可将表达类型相似的基因分为一组,聚类分析的方法有多种。对数据进行聚类分析具有两个优点:一是聚类分析后的数据经过分类易于操作;二是可能会出现新类型的未知功能基因。DNA微阵列表达谱分析的一个重要方面是研究未知功能基因的表达情况。在相同条件、相同时间、具有相同表达变化的基因往往属于同一调控途径。因此,通过挖掘表达数据可以对其中未知功能的基因进行注释。用生物信息学方法分析DNA微阵列技术所产生的海量数据,为寄主病原物互作中特殊基因功能的预测带来了新的希望。在对全基因组所有基因表达情况进行统计分析的基础上,应对差异表达基因进
14、行生物信息学分析,从中挑选目标基因深入地进行功能研究。虽然通过进行生物学重复可以消除DNA微阵列分析所得到的数据存在假阳性这一问题9,但是在对目标基因进行深入研究前,必须采用其它试验技术(如实时定量PCR和Northern杂交技术)对微阵列结果进行验证。此外,在对基因功能进行分析时,仅依靠序列一致性和表达情况并不够,微阵列分析结果只是推知基因功能,功能确定需要通过常规分子生物学技术来进行,如最常见的基因敲除和沉默分析。另外由于原核生物mRNA转录水平与蛋白质表达及其活性并不是完全一致的。因此,蛋白质组学分析将会有助于加深对寄主病原物互作的认识和了解。蛋白质微阵列技术的应用和发展将深刻革新蛋白质
15、组学的研究,近来已有大规模研究病害发生过程中的蛋白质种类和性质变化的报道。3 植物病原细菌基因转录谱研究3.1 植物病原细菌基因转录谱的体外研究细菌能迅速调节基因表达适应外界环境的变化。细菌的DNA微阵列转录谱分析就是要获得细菌在不同条件下适应性基因的表达情况,为基因与表型之间建立直接或间接联系。在病原细菌早期侵染过程中,由于寄主植物体内的病菌量少,用DNA微阵列技术来检测病原细菌表达谱会遇到很大困难。因此,一些研究者尝试获得在不同离体条件(或模拟植物体内微环境)下病菌的基因表达谱。植物病原细菌基因转录谱的体外研究主要集中在对环境变化的转录应答、不同致病型菌株之间的比较分析、利用诱导培养基模拟
16、体内环境分析和利用突变体研究基因表达调控几个方面。热激反应是生物本身长期适应环境的一种应答机制,具胁迫抗性使得生物具有一定环境适应性和进化可塑性。Koide等10用全基因组微阵列研究了植物病原细菌苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)的热激应答机制,发现在受到热胁迫时其中261个(9.7%)基因被诱导表达,222个(8.3%)基因表达受到抑制。对这些基因进行的分析表明,热胁迫对细菌致病性有重要影响,热激应答过程中许多不同的基因通过复杂的网络共同发挥作用。因子在对环境刺激的应答反应和毒力产生方面发挥着重要作用。da Silva Neto等11对苛养木杆菌rpoE缺失突变体进行热激后的
17、全部基因表达分析,鉴定了2个依赖于E的基因,这些基因编码不同功能的蛋白,在蛋白质折叠与降解过程中发挥作用,并参与信号转导过程。通过分析不同致病型菌株之间的表达谱差异,研究植物病原细菌的系统进化,能更好地了解病原菌致病性形成机制。Sarkar 等12比较了从花椰菜、大白菜、大豆、水稻和番茄等植物上分离的丁香假单胞菌的基因表达谱,获得了这些不同致病变种间的基因组进化信息。Guidot等13利用青枯菌菌株GMI1000全基因组微阵列研究了18个代表性菌株,鉴定出2 690个所有菌株的共有基因和2 338个变化基因。研究植物病原细菌在模拟植物体内微环境中的基因表达谱,是了解细菌致病机制的有效手段。As
18、tua-Monge等14比较了柑橘溃疡病菌在NB(丰富培养基)和XVM2(模拟植物细胞间微环境的培养基)上生长时279个致病相关基因的表达变化,发现用XVM2 培养的细菌有31个致病相关基因表达上调,7个基因表达下调。笔者比较了在营养丰富培养基NBY和诱导hrp基因表达的XOM2培养基上,水稻白叶枯病菌双组分调控系统应答调节子GacAxoo的基因缺失突变体与野生型菌株在不同生长时期的基因表达谱,鉴定了一批受GacAxoo调控的基因。3.2 植物病原细菌基因转录谱的体内研究研究植物病原细菌在侵染过程中的表达谱的主要难题在于如何从受侵染的植物组织中分离出足够数量的细菌RNA用于微阵列检测,同时保证
19、所获得的RNA样品中无寄主植物RNA的污染。目前应对这一难题主要有以下3种方法:第一,从植物病组织中分离出足够数量的病原细菌,然后进行RNA提取。Okinaka等15将接种菊欧文氏杆菌的非洲紫罗兰病叶切成两半,进行离心,将所得的细菌悬浮液迅速离心,然后进行总RNA提取。Mehta等16将接种柑橘溃疡病菌的柑橘病叶片切碎,置于无菌水中浸泡,使细菌从叶片组织释放到水中,将菌液离心,进行细菌RNA的提取。笔者在研究过程中剪取接种白叶枯病菌的水稻病叶,迅速用70%乙醇表面消毒后,剪碎成0.5 cm的小段,置于特制的离心管中(底部带有筛孔的小离心管放置垫圈上置于大离心管中),于室温10 000 r/mi
20、n离心1 min,立即提取总RNA,通过这种方法获得的RNA能很好地应用于微阵列杂交分析。第二,从植物病组织中提取混合样品总RNA(包含细菌和植物RNA),然后在制备探针时,用特异引物选择性地合成细菌cDNA,从而克服样品中的寄主RNA对试验造成的干扰。Talaat等17设计了一种计算机算法,设计了37条寡核苷酸特异性引物,用来合成结核杆菌基因组中所有基因的cDNA。这些基因组序列定向引物(genome-directed primer,GDP)比随机引物更能特异性地合成细菌cDNA探针,用于对病原细菌表达谱的灵敏检测。Dellagi等18用10条寡核苷酸引物,从番茄病叶总RNA中选择性地合成了
21、胡萝卜软腐欧文氏杆菌的cDNA。笔者设计和合成了74条GDP,每条引物长度为8 mer,覆盖了水稻白叶枯病菌基因组全部4 637个ORF,成功地应用于病菌侵染后1 d和3 d的基因表达谱检测。第三,从寄主病组织中直接提取细菌RNA。例如,Ambion公司设计生产了专门用于提取寄主病组织中细菌RNA的试剂盒RNAlaterTM,可以在RNA提取前“冻结”基因的表达谱。将病组织迅速浸泡在RNAlater中,后者可以透过寄主和细菌的细胞膜,快速使内源RNA酶以及其它酶类失活,使RNA量不再发生变化,保持其完整性。经RNAlater处理的组织再用RiboPureTM试剂盒提取细菌RNA,其基本原理是选
22、择性的裂解寄主组织,去掉寄主的RNA和组织碎片,然后再裂解细菌提取其RNA19。在研究病原物在寄主体内的基因表达谱时,结合寄主的基因表达情况进行研究,有助于深入了解病原菌的侵染机制和寄主的防御机制。Lan等20等用DNA微阵列分析了拟南芥受丁香假单胞番茄致病变种的效应子诱导后的基因表达谱,鉴定了其中参与脱落酸生物合成和受脱落酸调节的基因;受效应子诱导后上调表达的基因中有42%受脱落酸调节。用无法合成脱落酸的拟南芥突变体与病菌进行互作,研究表明,病原细菌可能通过效应子破坏寄主的激素分泌的动态平衡,以抑制寄主的防卫应答。4 其它细菌基因转录谱分析4.1 细菌对其周围环境变化的转录应答反应细菌在营养
23、匮乏条件下及寄主体内存活时,必须能迅速感知环境变化及营养状况等,并据此迅速改变基因表达以调节生长状况。不同营养条件下的细菌转录谱的研究主要集中在以下几方面:比较细菌在最基本培养基与丰富培养基上的表达谱变化,利用特殊的营养缺陷型培养基进行表达谱研究,诸如某种氨基酸的缺失,氮源缺失,氧气条件及离子缺失等。Hu等21利用DNA微阵列研究了新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)在重金属存在时的基因转录谱,发现该细菌通过将重金属在胞外形成沉淀和利用离子泵转运等机制降低重金属的危害,同时还发现许多编码膜蛋白和未知蛋白的基因上调表达。Nakamura等22研究了百日咳博德特氏菌(Bord
24、etella pertussis)在不同生长时期及其主要营养物谷氨酸缺乏时的表达谱,发现在谷氨酸缺乏时的基因表达与平台期类似,许多毒性因子表达水平下降9。细菌在特定环境中产生并向环境中释放特定的细胞外信号分子,随着个体密度的增大、信号分子积累到一定浓度时,诱发细菌群体感应(Quorum-sensing)行为。革兰氏阴性菌和阳性菌中均存在一类自体诱导信号分子呋喃硼酸二聚酯,用来感知种内自身种群数量,协调多种基因的表达。呋喃硼酸二聚酯的合成受luxS基因所调控。luxS基因还参与调节原核和真核生物中许多生物学功能。Yuan等23利用表达谱分析技术,鉴定了牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas
25、gingivalis)受luxS调控表达的基因。病原物寄主间的互作也是DNA微阵列表达谱研究的一个重要方面。通过比较寄主体内与体外培养条件下的表达谱变化,可以为鉴定新的毒性基因作为防治靶标提供依据24。Talaat等25比较了小鼠体内和体外培养条件下结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的基因表达谱,并进一步比较了在免疫缺陷型小鼠和已产生抗体的小鼠中结核杆菌的基因表达情况,为该病菌的诊断和制备疫苗打下基础。4.2 细菌操纵子结构鉴定与基因转录调控解析在细菌基因组中功能相关的基因前后相连,再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点(启动子、操作子等)在基因转录时协
26、同动作,组成操纵子(operon)结构。操纵子是细菌基因表达和调控的一个完整单元。Sabatti等26建立一种利用表达谱数据预测操纵子结构的方法。利用已发表的大肠杆菌DNA微阵列数据,比较已知属于同一操纵子之间的基因的表达情况,通过分析已确知属于同一操纵子之间和不属于同一操纵子之间的基因的关联表达情况,进一步来对未知基因之间的表达情况进行分析。结果表明,属于同一操纵子的基因表达情况高度一致,据此可分析未知基因。在确定操纵子的基础上,结合DNA微阵列表达谱技术、生物信息学和遗传工程方法就能够揭示细菌基因组的调控网络。表达谱分析可以用于研究基因表达的调控系统(如因子、全局调控因子和双组分调控系统等
27、)。大多数原核生物采用一种“双组分系统(two-component system)”来调控蛋白质磷酸化,进行信号转导,双组分系统广泛地参与了微生物的各项生命活动,尤其是在致病性和抗生素抗性等方面27。Liang 等28利用DNA微阵列和实时定量PCR技术相结合,分析了金黄色葡萄球菌中SaeRS双组分系统调控的调控机制,发现SaeRS调控与附着和侵入相关基因的表达,在saeS突变体中,agrA上调表达,表明SaeRS双组分调控系统负调控Agr调控系统。同时利用小鼠侵染模型进行的研究表明,SaeRS双组分系统的激活在附着和侵入上皮细胞的过程中起到了重要作用。4.3 细菌基因组分型与遗传工程改良依据
28、参考菌株基因组信息制备DNA微阵列,然后将同一小种的不同菌株同时进行杂交分析,表达谱相似的表明基因组结构相似29。这种基因组分型方法在流行病学的研究中应用十分广泛。通过对致病菌株和无毒菌株进行遗传差异比较,可以鉴定出致病因子,揭示致病性的分子基础和进化动态。细菌具有易于培养和改造的特点,研究者们常常对工程菌株的遗传特性与代谢途径进行改造以达到所期望的表型,从而能生产满足需要的细胞产物(重组蛋白、代谢物等)。但是遗传背景的改变会给细菌带来代谢压力,而DNA微阵列技术可以检测在分子水平的细胞应答,这使得它成为遗传工程菌的改造和优化过程中的一个有效工具30。用DNA微阵列筛选优良菌株,分析发酵生产条
29、件,可大大提高遗传工程的效率。5 结束语 随着DNA微阵列技术的建立和日趋完善及其在植物病理学研究中的应用,为病原细菌致病机理的研究带来了新思路并开辟了新途径。利用DNA微阵列技术,检测病原细菌在各种不同生长条件下和在植物侵染过程中不同阶段的基因转录谱,可以识别差异表达显著的重要候选基因,从基因组水平上鉴定出与致病性/毒性和适应性相关的新基因及其表达调控网络,有助于阐明这些基因在病原细菌寄主互作中的生物学功能,从而最终为植物细菌病害防治措施的制定提供科学依据。DNA微阵列技术分析为已往的有关遗传多样性和基因功能假说增加了新的见解,但仍然需要结合其它技术进行验证。例如,为了验证微阵列试验结果,需
30、要用实时定量PCR方法对差异表达显著的重要候选基因的表达进行定量确证,并用基因敲除的方法分析基因的生物学功能。对细菌及其寄主的表达谱同时进行研究,也将会更加深入地阐释病原细菌的侵染机制。对DNA微阵列技术产生的海量数据进行阐释,是一个巨大挑战。用生物信息学方法对不同DNA微阵列试验所产生的数据进行有效整合,将是全面和深入地理解全基因组水平基因表达谱的信息、并加以利用的关键所在。 References1Ehrenreich A. DNA microarray technology for the microbiologist: an overview. Applied Microbiology
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