1、刘建军，等.骨髓间充质干细胞对前列腺癌细胞生物学行为的影响中国组织工程研究第20卷第14期 2016 -04-01出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 1, 2016Vol.20, No.14研究原著骨髓间充质干细胞对前列腺癌细胞生物学行为的影响刘建军，段小雨(河南省人民医院泌尿外科，河南省郑州市450000)引用本文：刘建军，段小雨.骨髓间充质干细胞对前列腺癌细胞生物学行为的影响J.中国组织工程研究，2016, 20(14):2046-2051.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.
2、010ORCID: 0000-0001-7905-7533(刘建军)文章快速阅读:骨髓间充质干细胞对前列腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响Transwell 培养 小室前列腺癌Du145细胞和骨 髓间充质干细胞共培养检测方法：(1)流式细胞仪检测前 列腺癌Du145细胞的 细胞周期(2)软琼脂克隆形成实 验检测细胞增殖活性 结晶紫染色观察 Du145细胞迁移能力结论：骨髓间充质干细胞通 过缩短前列腺癌Du145 细胞 G2/M+S 期，可抑制前列腺癌Du145细胞的增殖和 侵袭能力刘建军，男，1970年生， 河南省长葛县人，汉族， 2006年四川大学毕业， 博士，副主任医师，主要 从事泌尿男生殖系肿
3、瘤 研究。中图分类号：R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344(2016)14-02046-06稿件接受：2016-02-15http:/WWW.crter.org文题释义：前列腺癌DU145细胞：DU145是从一位有3年淋巴细胞白血病史的前列腺癌患者的脑部转移灶中建立的。该细胞系未检测到激素敏感性，酸性磷酸酶阳性，单个的细胞可在软琼脂中形成集落。对此细胞和原始肿瘤的亚显微结构分析可见微绒毛、微丝、细胞桥粒、线粒体、发达的高尔基体和异质溶酶体。克隆形成率：反映细胞群体依赖性和增殖能力2个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，
4、传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。摘要背景：研究表明，骨髓间充质干细胞与肿瘤的发生和发展具有密切关系，不仅表现为对肿瘤有明显的募集作用，还表现在干预肿瘤细胞的生物学行为。目的：探讨骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞生物学行为的影响。方法：采集健康成人骨髓间充质干细胞，实验组将前列腺癌Du145细胞和骨髓间充质干细胞分别接种于Transwell小室的上下两室进行共培养，阳性对照组为人真皮成纤维细胞HDF-a细胞与人前列腺癌Du145细胞共培养，阴性对照组为野生型前列腺癌Du145细胞单独培养。培养 3 d后，流式细胞仪检测前列腺癌Du14
5、5细胞的细胞周期，软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖活性，结晶紫染色观察Du145细胞迁移能力。结果与结论：与阳性对照组相比，实验组处于G2/M+S期的细胞比例、透过滤膜数量和克隆形成数明显减少；结果表明，骨髓间充质干细胞通过缩短前列腺癌Du145细胞G2/M+S期，抑制前列腺癌Du145细胞的增殖和侵袭能力，为前列腺癌的治疗提供新的思路和方法。 关键词：干细胞；肿瘤干细胞；前列腺癌；骨髓间充质干细胞；Du145细胞；细胞周期；细胞增殖；侵袭能力 主题词：骨髓；间质干细胞；前列腺肿瘤；细胞周期；细胞增殖；组织工程 基金资助：河南省科学技术厅基础与前沿技术研究项目(152300410157)Liu
6、Jian-jun, M.D., Associate chief physician, Department of Urinary Surgery, Henan Provincial People s Hospital, Zhengzhou 450000, Henan Province, ChinaEffects of bone marrow mesenchymal stem cells on the biological behavior of prostate cancer cellsLiu Jian-jun, Duan Xiao-yu ( Department of Urinary Sur
7、gery, Henan Provincial People s Hospital,Zhengzhou 450000, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have a close relationship with tumor occurrence and development, which are not only involved in tumor recruitment but impact the biological behavior of tumor cells.
8、OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the biological behavior prostate cancer cell line.METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells from healthy adults were collected and cultured in vitro . Cell morphology and cell markers were observed. Using the Trans
9、well technique, human dermal fibroblasts HDF-a were co-cultured with human prostate carcinoma DU145 cells in positive control group, wild-type prostate carcinoma DU145 cells cultured alone in negative control group, and bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with human prostate carcinoma DU1
10、45 cells in experimental group. Flow cytometry assay was used to detect the cell cycle of prostate carcinoma DU145 cells, soft agar colony formation assay performed to detect cell proliferative ability, and crystal violet staining used to observe DU145 cell migration at 3 days after culture.RESULTS
11、AND CONCLUSION:Compared with the negative control group, cell proportion at G2/M+Sphase, number of transmembrane cells and colony counting were significantly decreased in the experimental group. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells may inhibit the proliferation and invasio
12、n of prostate carcinoma DU145 cells by shortening the G2/M+S phase, therebyproviding a new insight into the treatment of human prostate cancer.Subject headings: Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Prostatic Neoplasms; Cell Cycle; Cell Proliferation; Tissue EngineeringFunding: the Basic and Cutting-
13、Edge Technology Research of Hebei Provincial Science and Technology Department, No. 152300410157Cite this article: Liu JJ, Duan XY. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on the biological behavior of prostate cancer cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(14):2046-2051.ISSN 2095-4344
14、 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH20470 引言 Introduction前列腺癌是发生于男性前列腺的上皮性恶性肿瘤之 一，包括腺癌、导管腺癌、 鳞状细胞癌、腺鳞癌等多种类 型，其中腺癌占95%以上，发病年龄在55岁后逐渐升高， 发病率随着年龄的增长而增长。目前临床对早期前列腺癌 治疗主要采用手术方式，但复发率高，而对于晚期前列腺癌却缺乏有效的治疗手段。间充质干细胞是近年来医学、 生命科学等领域的研究热点之一，其来源丰富，主要有脐 带、骨髓、脂肪等组织1-4,其中研究最多的是骨髓间充 质干细胞。间充质干细胞易于体外培养，可分化为神经元 样细胞、成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞
15、、骨骼肌细胞、 成软骨细胞等5-15,对受损组织具有一定的修复功能，是 目前科学研究中最具潜力的移植细胞16-19 o实验采集健康成人骨髓间充质干细胞，评价骨髓间充质干细胞对人前列 腺癌Du145细胞的生物学作用。1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计随机细胞学分组实验。1.2 时间及地点于2014年2至7月在河南省人民医院实验室完成。1.3 材料 无菌条件下采集3名健康成人骨髓各 10 mL ,年龄20-30岁。标本采集前均获得供者的知情同 意，研究方案得到河南省人民医院伦理委员会批准。人 前列腺癌肿瘤细胞株Du145采购于上海酶研生物科技有限公司（产于USA
16、）。骨髓间充质干细胞干预前列腺癌细胞实验所用主 要试剂及设备：超洁净实验操作台（苏州净化设备公司）; IX71倒置显微镜、090-135.001型荧光显微镜 （日本 Olympus公司）；0.22 师针式滤菌器（美国Millipore公 司）；EPICS-XL型流式细胞仪（Beckman Corlter 公司）； 无菌磷酸盐缓冲液（上海麦莎生物科技有限公司）；低糖 培养基 （美国Gibco公司）；标志物各抗体（BD公司）；胎牛 血清、胰蛋白酶（Hyclon公司）。1.4 实验方法1.4.1 前列腺癌肿瘤细胞的培养将人前列腺癌肿瘤细胞株Du145细胞置于37 C、体积分数为5% CO 2、饱 刘
17、建军，等.骨髓间充质干细胞对前列腺癌细胞生物学行为的影响.CRTER .org和湿度细胞培养箱中孵育，倒置显微镜观察肿瘤细胞株 的生长状态，及时更换细胞培养基，取对数生长期细胞 进行三维培养以及其他相关实验。1.4.2 人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定无菌条件下采集健康者骨髓各10 mL ,置于含有肝素的EP管中，再加入等量的无菌磷酸盐缓冲液(含体积分数为2%胎牛血清)。细胞悬液于低温条件下，以2 000 r/min离心10 min ,弃去上清液，轻轻加入淋巴细胞分离液上层， 以3 000 r/min离心15 min ,取界面单个核细胞层，用磷 酸盐缓冲液润洗2次，以2 000 r/min
18、离心5 min ,弃去上 清液，加入培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度约3.0 M06 L-1接种于培养瓶(含DMEM培养基+体积分数为 10%胎牛血清)，置37 C、体积分数为5%CO 2培养箱培 养2 d, 0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以细胞 浓度约为3.0X10 6 L-1接种进行传代。1.1.3 骨髓间充质干细胞表面标志物的鉴定取第5代骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化，以 1 500 r/min离心 5 min ,收集细胞沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，分别力口入 CD45、CD14、CD29、CD34、CD105 、CD73、 CD90荧光标记抗体培养 30 min ,无菌
19、磷酸盐缓冲液洗 涤3次，40 g/L多聚甲醛溶液固定，流式细胞仪检测细胞表面标志物抗原表达。1.1.4 骨髓间充质干细胞与前列腺癌Du145细胞共培养取第5代骨髓间充质干细胞与人前列腺癌肿瘤细胞 株Du145细胞，分别接种于 6孔板的Transwell上下两室 中，上室骨髓间充质干细胞为2X10 5个，下室前列腺癌Du145细胞为3X105个。阳性对照组为人真皮成纤维细 胞HDF-a细胞与人前列腺癌 Du145细胞共培养，阴性对 照组为野生型前列腺癌 Du145细胞。1.1.5 细胞侵袭实验培养3 d后，取对数生长期各组细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含牛血清白蛋白的培 养基重新悬浮，计数后
20、调整细胞浓度为2X108 L-1O取0.2心聊胞悬液接种于 Transwell小室，于培养箱中培 养48 h, 40 g/L多聚甲醛固定2 h,然后用0.5%考马斯 亮蓝染色20 min ,显微镜观察和计数。1.1.6 细胞增殖能力细胞克隆形成数是评价细胞增殖能力的重要指标，各组细胞培养3 d后，通过软琼脂克隆形成实验法检测细胞增殖能力。1.1.7 细胞周期检测培养3 d后，取对数生长期各组细胞，0.25%胰酶消化，以2 000 r/min低温离心10 min , 弃上清液，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入预冷的无水乙醇，于4 C低温条件下固定 24 h ,以2 000 r/min 低温离心
21、10 min ,弃上清液，用1 mL无菌磷酸盐缓冲 液洗涤细胞2次，再加入含碘化丙咤 50 mg/L、RNA酶A 100 mg/L、0.2%Triton X-100 的磷酸盐缓冲液 0.5 mL , 避光于4 c低温条件下培养 30 min。按照流式细胞仪检 测程序检测各组细胞周期。1.5 主要观察指标骨髓间充质干细胞形态及标志物鉴定。共培养前列腺癌Du145细胞周期、细胞增殖、 细胞侵袭能力。1.6 统计学分析实验数据符合正态分布，采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以xis表示，组间比较采用t检验，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 骨髓间充质干
22、细胞的形态利用密度梯度离心法从健康成年人骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，接种于培养瓶中培养2 d,去除未贴壁细胞，更换细胞培养液， 置37 C、体积分数为5%CO 2培养箱中继续培养，骨髓 间充质干细胞完全贴壁，呈现出三角形或长梭形、多边 形等多种形态，细胞内折光性强，颗粒不明显(图1)。2.2 骨髓间充质干细胞表面标志物表达流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物CD29 、 CD73 、CD90、CD105呈阳性表达，阳性表达率分别为 98% , 97% , 96% , 95% ;而 CD14、CD34、CD45 呈阴性表 达，阳性表达率分别为 0.22% , 0.83% , 2.11%。2
23、.3 骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞周期的影响 G2/M+S期细胞百分比是评价体外培养细胞增殖 能力和水平的重要指标之一，各组细胞培养3 d后，流式细胞仪检测各组Du145细胞周期变化。阴性对照组G2/M+S细胞百分比为(45.73 =3.54)% ,实验组G2/M+S 期细胞百分比为(25.33 i2.01)% ,阳性对照组G2/M+S期 细胞百分比为(58.22丑.58)%。与阳性对照组相比，实 验组G2/M+S期细胞百分比显著减少，差异有显著性意 义(P 0.01)。2.4 骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞增殖的影响细胞克隆形成数是评价细胞增殖能力的重要指 标，各组细胞
24、培养 3 d后，通过软琼脂克隆形成实验检 测细胞增殖能力。与阴性对照组克隆形成率(78.09 士15.36)%相比，实验组克隆形成率明显减少(31.44 士11.37)% ,差异有显著性意义(P 0.01);阳性对照组克 隆形成率(120.82 19.16)%明显增加，差异有显著性意 义(P 0.01) o与阳性对照组相比，实验组克隆形成率 显著减少，差异有显著性意义(P 0.01) o2048P.O. Box 10002, Shenyang110180 www.CRTER.org图1骨髓间充质干细胞形态(及00)Figure 1 Morphology of bone marrow mesen
25、chymal stem cells ( 200)图注：图中可见骨髓间充质干细胞呈现出三角形、长梭 形、多边形等形态。2.5 骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞侵袭能力的影响 各组细胞培养3 d后，通过Transwell实验检 测穿过滤膜的细胞数量，与阴性对照组穿过滤膜的细胞数量(36.33 571)个相比，实验组穿过滤膜的细胞数量明显减少(16.32 4.07)个,差异有显著性意义 (P 0.01);阳性对照组穿过滤膜的细胞数量明显增加 (47.85 5.34)个,差异有显著性意义(P 0.01)。与阳 性对照组相比，实验组穿过滤膜的细胞数量显著减少，差异有显著性意义(P 0.01) O
26、3 讨论 Discussion骨髓间充质干细胞自身增殖能力强、分化范围广，具有免疫调节和修复损伤组织等功能，且不涉及伦理道德方 面的问题。此外，它们还具有归巢性，所以可能作为运载 工具定向运送生物制剂来治疗某些疾病。目前，骨髓间充质干细胞已在动物实验和临床应用中取得了巨大的成果， 包括骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、肝损 伤、脊髓损伤等方面都有突破。国内外研究显示，间充质干细胞具有抑制癌细胞生长、侵袭和转移的能力20,在炎 症或损伤组织中，间充质干细胞会迁移到特定组织21-26 O越来越多的证据表明，骨髓间充质干细胞在癌症治疗中具 有明显的优势27-32 O骨髓间充质干细胞的分离方法
27、众多， 目前为止尚未发现一个特定的细胞标记可以鉴定骨髓间 充质干细胞，而且骨髓间充质干细胞在不同的生长时期和 不同的生长条件下具有较大的差异。骨髓间充质干细胞低密度培养在添加表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中。 结果显示,骨髓间充质干细胞在无血清的基础培养基中培养时表达nestin和胶原纤维酸性蛋白的细胞数量明显增多，同时Oct4、SOX2、klf4 和c-myc等基因的表达也明显上调去除血清后导致了整个细胞群体的增殖显著降低，尽管在这一过程中细胞会坏死、凋亡，但是还是有一小部分细胞存活下来，并且在重新添加血清后它们又开始增殖。实验成功利用密度梯度离心法从健康成年人骨髓中分离
28、出骨髓间充质干细胞 33-42,骨髓间充质干细胞完全贴壁生长，呈现出三角形或长梭形、多边形等多种形 态，细胞内折光性强，颗粒不明显，细胞标记物CD29、 CD73、CD90、CD105 呈阳性表达，CD14、CD34、 CD45呈阴性表达。实验分为3组，分别为阳性对照组、阴性对照组 及实验组。阳性对照组为人真皮成纤维细胞HDF-a细胞与人前列腺癌 Du145细胞共培养，阴性对照组为野 生型前列腺癌 Du145细胞，实验组接种骨髓间充质干 细胞与人前列腺癌 Du145细胞共培养。流式细胞仪检 测细胞周期：与阴性对照组相比，实验组G2/M+S期细胞比例明显减少，阳性对照组G2/M+S期细胞比例明显
29、增加，差异有显著性意义(P 0.01) o软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖能力：与阴性对照组相比，实 验组克隆形成率明显缩短，阳性对照组克隆形成率明显增加，差异有显著性意义(P 0.01) o Transwell实验检测细胞穿过滤膜的细胞数量：与阴性对照组相比，实验组穿过滤膜的细胞数量明显减少，阳性对照组穿过滤膜的细胞数量明显增加，差异有显著性意义(P 0.01)。通过骨髓间充质干细胞与人前列腺癌Du145细胞的体外共培养实验显示，骨髓间充质干细胞通过缩短前 列腺癌Du145细胞G2/M+S期，抑制前列腺癌 Du145 细胞的增殖和侵袭能力，为临床前列腺癌的治疗提供新 的思路和方法，但其作用机制
30、还需要进行后续实验进行 探索。作者贡献：实验设计、实施为刘建军，实验评估为段 小雨，资料收集为刘建军。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利 益冲突。伦理问题：采集健康成人骨髓用于提取骨髓间充质干 细胞，得到所有供者知情同意，并签署知情同意书。文章查重：文章出版前已经过 CNKI反剽窃文献检测 系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不 端行为承担责任。论文中及的原始图片、数据 （包括计算 机数据库）记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁， 可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全
31、体作者授权人签署 了版权相关协议。4 参考文献 References1 Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002;418(6893):41-49.2 K? gler G, Sensken S, Airey JA, et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent
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