1、巴比妥疗法治疗弥漫性轴索损伤（附 21 例报告）第 29 卷第 1 期吉林大学(医学版)Vo1.29No.12003 年 JournalofJilinUniversity(MedicineEdition)2003文章编号1671-587x(2003)01-0115-04提高石蜡包埋组织中提取 DNA 质量的实验研究盖宝东,房学东,金仲田,张德恒,郑泽霖(1.吉林大学中日联谊医院基本外科,吉林长春 130031;2.日本东北大学医学部先进外科)摘要目的:确定从石蜡包埋组织中提取 DNA 的最佳条件.方法: 改变石蜡切片厚度,组织脱蜡时间,消化液蛋白酶 K 浓度,组织消化时间等参数,组合出 96
2、种不同提取 DNA 的条件,比较各种条件下所提取 DNA 的数量和质量.结果:各种条件均可以提取出一定数量的DNA,但有些条件所提取的 DNA 不适合于做 PCR 及 DNA 序列测定.结论 :从石蜡包埋组织中提取DNA 的最佳条件为,10.0|Im 组织切片 ;切片脱蜡 2 次,脱蜡时间分别为 2h 和 12h;消化液中蛋白酶K 浓度500mg?L;组织消化 12h.关键词 石蜡包埋 ;DNA/分离和提纯 ;聚合酶链反应; 序列分析,DNA中图分类号Q781文献标识码 A从石蜡包埋组织中提取 DNA 可以解决在短期内难以收集到大量有用标本的难题,但组织经甲醛,石蜡包埋后很容易引起 DNA 的
3、交联和降解,使研究工作受限.如何从石蜡包埋组织中提取高质量的DNA 是一个迫切需要解决的问题.本文作者经过多次尝试,通过改变石蜡切片厚度,组织脱蜡时间,消化液蛋白酶 K 浓度,组织消化时间等实验参数摸索出一组最佳提取 DNA 的条件,经检验可以满足PCR,DNA 荧光标记,DNA 序列测定等分子生物学实验要求.1 材料与方法1.1 标本 4 年前手术切除的散发型甲状腺髓样癌组织,组织块全部为癌组织,质地均一,经1O 中性甲醛固定 12h 后石蜡包埋,室温存档至今.1.2 试剂蛋白酶 K,Tris 碱,EDTA,SDS为 Sigma 公司产品,二甲苯,乙醇,苯酚,氯仿,异戊醇,醋酸钠为日本和光纯
4、药工业株式会社产品,TaKaRaExTaqPCR 反应试剂盒为日本宝酒造株式会社产品,QIAquickGelExtractionKitDNA 纯化试剂盒为德国 QIAGEN 公司产品,ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit 荧光标记试剂盒为美国 AppliedBiosysterns 公司产品 .扩增 RET 基因第 11 外显子 PCR引物由日本遗传子研究所合成,碱基序列:11F5-ACAGATCCACTGTGCGACGAG 一 3,11R5-ATCTTGAAGGCATCCACGGAG 一 3.1.3 条件设定根据石蜡切片
5、厚度(2.5,5.0,10.Ottm),组织切片脱蜡时间(切片脱蜡 2 次,时间分别为 2,2h 和 2,12h),消化液中蛋白酶 K 浓度(125,250,500,1000mg?L),组织消化时间(4,8,12,24h)等参数的不同,排列组合出 96 种不同条件,分别用于提取 DNA.1.4 提取 DNA 方法石蜡组织连续切片,2.5m 切片 4 片为 1 组,共计 32 组;5.0m 切片2 片为 1 组,共计 32 组;10.0m 切片 1 片为 1 组,共计 32 组.切片分别置人 1.5mlEppendorf 管中(A 管 ).A 管中加 1.0ml 二甲苯,置 4O恒温水浴中以 8
6、O 次/min 振荡脱蜡,切片脱蜡 2 次,时间分别为 2,2h 和 2,12h.1.0ml 无水乙醇漂洗切片2 次,置 75水浴中 20min 后离心去上清,真空干燥使组织切片完全干燥.加入细胞裂解液 300l(蛋白酶 K 浓度根据分组情况不同分别为 125,250,500,1000mg?L,10mmol?LTrisHCI.140mmol?LNaCl,2mmol?LEDTA,0.5%SDS),置 5O 恒温水浴中以 4O 次/min 振荡消化组收稿日期2002.05.24基金项目 中日甲状腺疾病合作研究项目(1993)作者简介 盖宝东 (1968 一), 男,吉林省长春市人,主治医师,医学博士,主要从事内分泌外科学研究
