1、液相色谱仪日常维护及维修,上海市药检所化学室李建华,液相色谱仪结构组成,流动相脱气机泵进样器柱温箱柱后衍生化装置检测器,流动相试剂,有机相：光学纯或HPLC级水：必须是新鲜的去离子水其它试剂：分析纯或更高注意：使用前均用相应的滤膜滤过（0.45m）,溶剂使用注意点,滤膜,聚四氟乙烯膜-双相尼龙66膜可过水和大多数有机溶剂醋酸纤维素滤膜适用于水性溶液（尤其是蛋白质和蛋白质相关样品）再生纤维素滤膜适用于水溶性生物样品和有机溶剂。注意：1.水膜和有机滤膜千万不可混用！2.分别滤过的水相与有机相的混合。,液相常用的溶剂过滤装置,溶剂过滤器检查,溶剂过滤器清洗,垂熔玻璃滤器：不锈钢烧结滤器：可用超声清洗
2、,流动相脱气,脱气作用脱气方式原理：1. 低压脱气2.氦气脱气3. 超声波脱气 4.加热回流脱气,流动相脱气作用,流动相脱气方式,1低压脱气法 电磁搅拌水泵抽空，可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽空和加温都会导致溶剂蒸发，对二元或多元洗脱液的组成会有影响，故此法适用于单一组成的洗脱液。2氦气脱气法 将氦气通过过滤器通入洗脱液中，在0.1MPa压力下，以约60ml/min流速保持1015min，用氦气的小气泡将溶于溶剂中的空气带出。此法简单方便，适用于所有洗脱液，只是氦气较贵。3超声波脱气法 将洗脱液瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气。一般500m1溶液约需2030min。此法方便，适于采用。
3、,三种脱气方式比较,在线脱气应用细节,氦气脱气：氦气起始流速一般设置3060ml/min，维持时间根据流动相体积来确定，分析时维持流速一般设置在5ml/min左右。真空在线脱气：脱气机每个通道的流动相相对固定，这样可避免相互干扰。更换溶剂排液要充分，并且要注意脱气机最大流速。,真空脱气机联接,真空脱气机工作原理,真空脱气机工作原理,脱气机维护,溶剂过滤器清洗溶剂更换不用通道溶剂更换或封堵排液时要根据脱气机类型选择流速、时间。注意：由于大部分连接头和 芯子都是塑料的，拧紧时千万 不可太用力。,脱气机故障,脱气机故障原因判断,真空泵故障：短接真空泵进、出口管路真空腔漏连接密封性溶剂半透膜破裂,泵,
4、分类：1.作用原理2.输液方式应用：单元泵多元泵：1.低压混合：比例阀2.高压混合：混合器,液相色谱的溶剂输送系统,低压、高压混合比较,低压混合四元泵工作原理,低压混合四元泵结构,Agilent 1100泵结构,密封垫冲洗装置,密封垫冲洗应用,泵应用细节,使用的流动相要与泵的压缩因子配对。特别是用梯度混合时。 对四元泵比例阀来说,密度大的流动相放下方（常规是水相溶剂应放在下方,有机溶剂放在上方）。二元或四元泵的冲程调小可获得较好的混合效果，但会影响密封垫寿命。梯度或比例阀的准确性可测定。,泵维护,泵维护,不同用途时溶剂选择,液相泵后常用在线过滤器,带可更换滤芯的在线过滤器图例,样品过滤器,溶剂
5、过滤器,过滤器元件,泵维护,多通道梯度阀进、出口单向阀清洗出口过滤阀清洗或更换Seal Wash的清洗及密封垫更换泵密封垫更换石英柱塞杆清洁、更换,维护信息,密封圈拆洗,泵密封圈更换,泵密封圈更换注意点：1.柱塞用牙膏棉球擦洗一下。2.密封圈在甲醇中浸泡5分钟用专用工具安装。3.泵座用水清洗一下。4.密封圈（注意不同类型）,密封垫磨合,常见泵故障和诊断,多通道梯度阀漏泵前出现气泡压力不稳泵不出流动相（松开purge阀）进、出口单向阀漏或堵塞压力高,泵压力不正常原因,溶剂过滤器阻塞气泡进、出口单向阀故障密封垫或柱塞杆磨损管路渗漏或堵塞比例阀故障压力传感器故障比例阀混合盐浓度太高,进样器,手动进样
6、器：1.垫塞进样 2.阀进样自动进样器：,手动进样阀,手动进样阀,Front View,Inject,Rear View,Load - Inject,Sample Loop,手动进样器操作原理,手动进样器操作原理,手动进样器,手动进样器：六通阀进样顺序：INJ时插针，LOAD时注射，再加INJ时运行排空管翘起高度要与针口平行六通阀接口最好用Rheodyne专用接头，减少死体积若用定量管来定量，则多进样（定量管体积1.5倍以上）转子密封圈若漏，可先将三个定位螺丝拧紧5-10度（如无效再更换转子）,在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，
7、密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。尽快转动阀，不能停留在中途，否则过高的压力在柱头上引起损坏。六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。,六通阀的使用,手动进样器维护,防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、
8、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，。,手动进样器维护,手动进样器维护,手动进样器维护,转子密封垫选择,Agilent 1100自动进样器工作原理,Agilent 1100自动进样器工作原理,自动进样条件优化,进样污染处理,进样污染处理,自动进样器维护,进样座与针外壁要在诊断中的change needle状态下，用水棉球及异丙醇棉球擦洗。若常用缓冲溶液，计量泵内的柱塞与密封圈，六通阀上的定子与转子密封圈要定期清洗。若六通阀的转子密封圈有划痕，可将三个固定螺丝各拧紧5到10度。机械部分要保持清洁，若有灰尘需取出机械臂，除尘并加稀牛油。定量环要在Configure
9、中定义，如100ul、500ul、900ul、1500ul。,自动进样器维护,更换针及针座更换转子密封圈,转子密封圈磨损判断：,自动进样器常见故障,柱温箱,连接头、管线预热器柱温箱色谱柱,HPLC连接用的接头,零死体积接头,不能使用的接头,HPLC常用的色谱柱接头,0.090 in.,0.130 in.,0.090 in.,0.170 in.,Swagelok,Waters,Parker,Rheodyne,Valco,Uptight,0.090 in.,0.080 in.,Troubleshooting LC Fittings, Part II.,J. W. Dolan and P. Upch
10、urch.,LC/GC Magazine 6:788 (1988),连接管线,柱温箱维护,进出柱温箱的管路一定要嵌入槽口内，以免折断管路。予热器要定期清洗，以防污染及堵塞。拆卸柱子要用两个板手，以免毛细管折断。使用peek管，要注意压力不要超过200bar，否则管子会弹出。温度设置比室温低时，要注意有水冷凝析出。,色谱柱分类,预柱：分析柱,预柱,液相色谱的预柱按其安装位置可分为两种。 一种是安装在泵和注射器之间，目的是使校免受腐蚀性的或受污染了的流动相的损害。腐蚀性的流动相逐渐溶解预柱卞的硅胶填料，使其在到达分析柱之前就已变得饱和因此不损害分析拄。另一方面，预柱可用来收集流动相中的痕量杂质。在
11、注射口前收集杂质比在注射口后往前)收集杂质好，因为在后一种情况下，有可能改变柱的选择性或产生鬼峰-在有梯度系统的情况下，这种预柱可放在泵的出口，混合槽的前面，达一类预拄的填料部宜有一定的容量并易于填充。 另一种预柱安装在注射口和分析柱之间，这种预柱主要用来防止脏的样品和已损坏的垫或其它材料进入分析柱。这种预柱是要通过样品的，所以与第一种不同，要求较高，它必须填充得很好，柱效较高，并且在功能上能和分析往匹配。另外，不管是和注射口的联接还是和分析柱的联接，都要注意尽量减少死体积，因为它是分析柱的一个延伸。,预柱和保护柱,由泵输送的流动相,预柱,进样器,保护柱,分析柱,至检测器,截留或浓缩柱,色谱柱
12、的安装,Whats needed:,The right connectors to avoid any future leak.,Guard column to protect the main column,The right tools,标准不锈钢分析柱,Capillary,S.S. Filter Frit 2 um Pore Size,Column Packing,Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required),卡套柱：带可重复使用的末端接头和一体化的保护柱柱芯,无保护卡套柱芯,有保护卡套柱芯,带Techtro
13、n 卡套柱芯的Zorbax 保护柱,min,5,10,15,20,25,30,35,mAU,140,142.5,145,147.5,150,152.5,155,157.5,160,min,5,10,15,20,25,30,35,mAU,140,142.5,145,147.5,150,152.5,155,157.5,160,BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm with integrated Guard Column,BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm without Guard Column,2 mm 内径卡套柱有和无保护柱的比较,高效液相色谱柱发展史,1
14、9世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 m 的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 10 m 球形硅胶。90年代早期，粒径为 5 m 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 m 或 3.5 m 的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 m 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅
15、胶基质填料主要为 B 型硅胶。,硅 胶基质材料,目前应用最为广泛的基质材料。高机械强度和高的比表面积。可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。高效。重现性好。pH 适用范围为pH 28。具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。,聚合物基质材料,交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 稳定性好：pH 1 13。可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。分离效率相对硅胶而言比
16、较低重现性不好,硅 胶 外 形,球形硅胶: 现代 HPLC 填料粒径小 (5 m, 3 m, 5 m柱床稳定性差比表面积较小价格便宜,硅 胶 纯 度,硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。以前的纯度较低的硅胶（称为 A 型硅胶）, A 型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。纯度高、酸性较弱的硅胶 (称为 B 型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。,硅胶纯度,硅胶孔径,硅 胶 粒 径,HPLC 色谱柱结构,
17、键 合 相,键合相:反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 硼酸盐 有机溶剂,溶解速度增加随:,柱压升高,检查有无色谱柱时的压力：应分段检查；大多数情况下问题出在系统和保护柱上。 如果确定是色谱柱的压力高： 冲洗柱 -除去柱污染物；大分子化合物；从样品和缓冲溶液带来的污染物 反冲柱压力高-清洗柱入口滤片 （20%硝酸水溶液-水）,色谱柱的清洗,以下溶剂每种至少25 mL（25cmx4.6mm),反相色谱柱的冲洗用比流动相强度大的溶剂,不含盐的流动相 100% 甲醇 100% 乙腈 75% 乙腈:25%异丙醇 100%异丙醇 100%二氯甲烷* 10
18、0% 正己烷*,* When using either Hexane or Methylene Chloride the column must be flushed with Isopropanol before returning to your reversed-phase mobile phase.,色谱柱的清洗,每种溶剂至少用 50 mL ；50% 甲醇 : 50% 氯仿100% 乙酸乙酯；100%所用流动相（正己烷等）,正相流动相的选择增强溶剂的强度,在色谱柱安装前、后测试压力差如果柱两端的反压很高，反接色谱柱，再用10-20倍柱体积的流动相冲洗柱体后，再测试压力差如果出现沉淀，
19、(如：蛋白质凝聚，细胞物，聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1% TFA / 80% 乙腈, 6M 盐酸胍, THF, HFIP等清洗以除去堵塞物若仍无效，应考虑更换过滤片,色谱柱的修复和再生-物理性阻塞,柱进样口滤片,密封垫圈,柱体,Female End Fitting,Male End Fitting,操作注意事项：带手套填料不能变干不要接触色谱柱体 加热填料会被挤出不要拧得过紧,色谱柱故障诊断更换进样口滤芯,由于键合相水解或硅胶溶解而造成的色谱柱填料变化是不可逆的 由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的洗清使之修复 梯度洗脱的方式 (水 - 强有机溶剂) 通常最有效 低 pH 流动
20、相, 如 0.1% TFA 或 0.01M H3PO4, 也是有效的 适当升高温度也有帮助 (60-80C),色谱柱的修复和再生-化学变化-I,某些溶液，如6M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素可用于清除蛋白质的沉积某些填料 (XDB, 有机聚合物)，可使用高pH 水/有机溶液，如：0.01M NaOH溶于50%异丙醇/水溶液。 硅胶基质应尽量减少接触时间 (15-30 min)。,色谱柱的修复和再生-化学变化-II,例子：4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18流速: 1 mL / min; 温度: 80CA: 0.1% TFA 水溶液 B: 0.1% TFA 乙腈溶液10
21、0% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return to 100% A in 5 min.重复3次,色谱柱日常维护,(1)每日开机时，流速和柱压要逐渐增加，突然迅速增加，会使柱床受到冲击，引起紊乱，产生空隙。(2)在注射样品前要使色谱系统平衡，是否平衡可由基线加以判断。(3)在注射样品前，用手摸一下色谱系统的各个接头，通常由此能发现柱是否有漏；漏得不严重时，可以用皮肤是否有冷感加以判断。空气会从漏缝进入系统引起基线漂移，影响峰高和峰面积的重复性。 (4)不要把柱接头拧得太紧。上得过紧容易损坏接头螺纹，
22、引起渗漏。拧螺丝时使用的扳手应短一些，不宜太长。,色谱柱日常维护,(5)不要把柱子放在有气流的地方或直接放在强光下，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度，造成基线漂移，如果怀疑基线漂移是由温度梯度引起的，可以设法使柱子绝热或恒温，也可用布(或毛巾)把柱和接头包起来。 (6)如果仪器用来做常规分拆，样品种类有限，但分析次数很多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。 (7)如果所注射的样品会污染柱子，可以用合适的溶剂(几百毫升)慢慢冲洗柱子过夜，第二天早晨再用流动相重新平衡校子(约30分钟)。(8)在因装卸、更换、贮存等而挪动柱子时，动作要轻，不要使其受到碰撞，以免柱床因震
23、动产生空隙或通道。(9)柱要加标签，新旧分开，不要放在温度变化很大的地方。,当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；,色谱柱维护,色谱柱的良好使用规范,溶剂使用前必须过滤避免使用高粘度的溶剂作为流动相运输中变干了的色谱柱，使用时要完全浸湿了解样品溶剂对溶解度及分离的影响进样样品要提纯，如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理严格控制进样量清楚了解色谱柱
24、填料适用的: pH范围，温度，化学适应性,色谱柱的良好使用规范,当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头定期用强极性溶剂冲洗色谱柱使用新鲜的水溶液,要注意使用生物稳定剂,如叠氮化钠每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭,柱子维护,卸下柱子和入口接头，可看到接头孔隙。如果柱头孔隙深度小于1厘米，可以来用下述局部重装的办法，否则，柱应当完全重装或更换。 柱入口局部重装时采用的填料可以和柱内原有填料一样，也可以用玻璃珠。 粒子大于20微米的可以用敲打
25、充填法干装。如果小于20微米则要用合适的溶剂配成淤浆，淤浆逐次加入，每次加入前都要使上一次加入的全部沉降。把孔隙填满后，用一把刮刀将续料刮乎更换柱入口接头，把柱重新接到液相色谱系统中，慢慢地增加流速和系统压力，直到操作上限为止。让相当于l0一20倍柱体积的流动相通过柱子，然后逐渐降低柱流速，并使压力降为零，再把柱子卸下来，并卸下入口接头，观察柱的入口，此时孔隙应当减小，但是由于新加入的填料在系统的操作压力下压缩柱头，孔隙不可能一次就被全部充满。重复上述局部至装过程，直到柱上加不进更多的粒子为止。一旦柱子填充完毕，可加进混合样品，测定柱子的性能是否已经改善。,柱维护,对于严重污染的反相住，也可采
26、用这样的办法：用泵依次打入水甲醇-二氯甲烷-己烷，然后把此顺序倒过来再打一遍，最后到水，不接检测器。 如果分析类脂化合物，也可使用易溶解油脂的溶剂如50ml二氯甲烷然后是50毫升甲醇。 其它有机物，如乙醚、四氢呋喃和二甲基亚砜也能用来清洗反相柱。另外也可使用络合溶剂如EDTA二钠等。 在任何洗涤中，升高温度都能加速杂质的溶解。,检测器,紫外检测器示差检测器荧光检测器电化学检测器电导检测器蒸发光散射检测器质谱,液相色谱的检测模式,灵敏度、选择性、及适应能力,DAD检测器光路,紫外检测器条件优化,紫外检测器条件优化,紫外检测器条件优化,流通池选择,紫外检测器条件优化,紫外检测器条件优化,紫外检测器
27、条件优化,紫外检测器条件优化,紫外检测器条件优化,紫外检测器条件优化,紫外检测器条件优化,紫外检测器日常维护,流通池测试、清洗及更换零件灯更换灯能量测试波长校正、校准,紫外检测器日常维护,波长校准,波长校准 检测器使用氘灯发射出的656.1nm和486nm射线进行波长校准，用尖线校准波长，所得到的精度优于氧化钬校准波长的结果。在进行波长校准时，1nm的狭缝进入光路，把增益设定为零，为消除溶剂对吸收的影响，在流通池中注入水进行试验。校准用氧化钬测试在三个附加波长进行精度确认。在流通池维护、灯更换、主板或元件更换之后，必须进行波长校准。,光强度测试,光强度测试,流通池测试,流通池测试,检测器泄漏,
28、基线噪音大的原因,泵压不稳气泡色谱柱、系统管路或流通池污染灯能量不足光学系统老化或污染参数设置不合理,检测池气泡消除,一旦确认池内有气泡，可推荐两种消除的办法： (1)取一块橡皮垫，在检测器出口放约30秒，它可增加池子的压力，溶解部分或所有气池如果使用的是恒流泵，可从泵的压力表中看到压力的增加，只要不让压力高于池子的允许压力即可。周期性地重复上述过程，这样反复的压力波动将减少甚至全部除去气泡。注意不要用手去堵出口，因为皮肤会吸收有机溶剂使之进入人体。 (2)把检测器出口接到注射器里，流动相不断推动注射器的活塞，增加检测器的负压，如果使用的注射器足够大，就有可能除去气泡。 如果上述办法尚不能除去气泡，还可以用甲醇充满检测池，然后重复上述过程。,检测器的保养,在分析前、柱平衡得差不多时，再打开检测器；紫外检测器的平衡时间大约需要20分钟，示差折光检测器则更长。在分析完成后，马上关闭检测器。检测池污染时，将柱拆下，用合适的溶剂冲洗污染物。,示差检测器分类,偏转式反射式干涉式,RID基线漂移,总结,仪器维护常见故障,液相日常维护,液相日常维护,液相常见故障,液相常见故障,液相常见故障,液相常见故障,液相常见故障,液相常见故障,
